發現螢光蛋白並利用基因工程對這些蛋白進行重組和最佳化後，擴展了生物學家的研究手段，他們可以在更廣泛的空間和時間解析度內對活細胞進行觀察，並可以進行細胞內分子追蹤、分子定量等研究，從而可以分析活細胞中蛋白質分布、運動、衍生物情況和生物化學特性。蛋白質功能研究已經被公認為繼測定基因組序列之後最重要的細胞活動研究重點。
基本介紹
- 中文名：光轉換螢光蛋白
- 外文名：Light conversion fluorescent protein
- 原理：基因工程
- 操作：重組和最佳化後
- 指示劑：Aequorea victoria
- 強度：增加了3倍
光活化螢光蛋白PA-GFP,三種典型光誘導蛋白,PA-GFP譜線和光活化特性,可擦寫光學蛋白Dronpa,Dranpa蛋白的光學特點,實驗操作要求,
光活化螢光蛋白PA-GFP
第一個被設計用於光活化研究的光學指示劑是一種Aequorea victoria水母的蛋白突變體，叫做PA-GFP（分別取photo和activatable的首字母）。這種GFP蛋白的光活化突變體是將野生型中性蛋白質改造為陰離子態得來的。在穩定狀態（unperturbed state）時，野生型綠色螢光蛋白在395和475nm處分別有一大一小兩個吸收峰。當用強紫外或紫光照射該蛋白時，發色團產生光轉化，從而改變了大小兩個吸收峰的相對消光係數的比值。結果是在488nm激發下，發射螢光的強度比未刺激前增加了3倍。
由上至下分別為FRAP、FLIP、光活化。
通過突變技術的PA-GFP降低了475nm處的吸收峰，在450~550nm處的吸收幾乎可以忽略不計，同時增強近紫外（約400nm）照射下野生型光轉化效率。因此極大增加了非活化和活化狀態之間的反差。光活化後，PA-GFP在504nm處的最大吸收增加了約100倍。這一現象極大增強了轉化和未轉化PA-GFP之間的差異，以此可以最終觀察其在細胞內的動態變化。
三種典型光誘導蛋白
顯示了光活化前後的PA-GFP吸收和發射峰曲線。圖中標明了用於光轉化的雷射波長（箭頭所示）和寬場弧光燈激發波段（黃色框）。圖3a中的活化後螢光發射曲線是在488nm雷射激發下得到的。用405nm固體雷射器可以激發目的位點，如圖3b所示。光活化後，綠色發射螢光的強度會明顯上升，如圖3c所示。
PA-GFP譜線和光活化特性
PA-GFP的光活化可以用來標記選定分子或整個細胞，並利用延時圖像技術獲取動力學特徵。在理想狀態下，只有活化的PA-GFP分子發射醒目的螢光，新合成的蛋白不會對實驗造成影響。PA-GFP的光活化會比利用GFP進行光漂白研究的速度更快、現象更明顯，而且用於光活化的雷射強度要遠小於FRAP的漂白雷射，對細胞的殺傷相對較低。因此該項技術非常適合活細胞中蛋白質的動態研究。
但需要注意的是在光轉化後，PA-GFP和野生型GFP螢光在488nm激發下都會表現同樣水平的增強。但從另一方面講，在未被光誘導（如405nm激發）前很難區分細胞是否表達PA-GFP，所以用顯微鏡很難提前確定確切的表達區域。
可擦寫光學蛋白Dronpa
從Pectiniidae（一種石化珊瑚蟲）中提取的單體螢光蛋白Dronpa
預示了新一代的可開關特殊螢光蛋白的誕生。Dronpa表現出了與眾不同的光變色性能，它可以用兩種不同的激發光控制螢光的開和關。
Dronpa螢光蛋白驚人的特點是可以在488nm下快速漂白，並且隨後又可以在405nm激發光刺激下完全恢復。這種模式的光漂白和活化可以反覆進行。
顯示了轉基因細胞中Dronpa蛋白在光漂白和光活化之間的可逆轉換。該細胞被轉染了只含有Dronpa蛋白基因（沒有其他融合基因）的質粒並在細胞培養瓶中培養。最初在488nm下標本顯示很明亮的綠色螢光（圖4，0s），50~60s後亮度逐漸衰減（圖4，0~55s）至檢測不到。螢光衰減曲線如圖4a中綠色曲線所示。用405nm近紫外雷射活化後，Dronpa蛋白的螢光強度恢復（圖4，紫色曲線）。同樣方法反覆光漂白和活化重複10次以上的圖形（圖4b）顯示，多次反覆後Dronpa螢光的恢復會有一定的衰減。10次循環後，Dronpa 螢光減少為原來的88%左右。
Dranpa蛋白的光學特點
光誘導變色螢光蛋白KEADE
目前已經從珊瑚蟲和海葵中提取和開發出了許多有套用潛力的光學指示劑。其中一個非常重要的是Kaede蛋白，受紫外激發後這種蛋白會產生從綠色到紅色的光轉化。光轉化後，紅/綠比會顯著增加約2000倍（紅增、綠減）。這一類具有獨特顏色轉換特性的光學指示劑會成為亞細胞器乃至整個細胞光學標記的最佳選擇。
顯示的是光轉化前後Kaede
蛋白的吸收、發射光譜曲線和細胞中兩種顏色螢光融合的動態圖像。分別用綠色的虛/實線代表轉化前Kaede蛋白的吸收/發射曲線，用紅色虛/實線代表轉化後Kaede蛋白的吸收和發射曲線。由圖可以看出，經過光誘導後紅和綠兩個螢光發射峰之間的差異非常明顯，發射峰值距離約為60nm。圖5a到圖5d數碼圖像為我們展示了光轉化前Kaede的綠色螢光，見圖5a，用405nm雷射對選擇區域進行短時間激發，如圖5b中紅色部分所示，轉化後Kaede蛋白逐漸擴散到整個細胞但沒有進入細胞核的動態圖像，見圖5c和圖5d。
Keade蛋白的光譜特徵和光轉化特點。
利用Keade蛋白在光轉化前後的明顯顏色變化，研究者可以持續追蹤紅色螢光的動態變化，進而描述出其標記的動力學特徵。利用這種顯著的顏色差異，這種蛋白還更多的被用於區分特異細胞和周圍類似細胞的實驗中。
實驗操作要求
在光轉化和光活化實驗中，選擇感興趣區域進行刺激的比較理想的操作方法是使用聲光調製器（acousto-optic tunable filter，AOTF），用它可以非常方便地定義光的波長通過範圍對標本進行光刺激。
但使用共聚焦和AOTF方法研究光轉化或光活化反應存在重要缺陷：刺激和取圖要共用同一對XY掃描振鏡，所以刺激和掃描只能分開在不同時間段進行。這樣操作存在幾個弊端：
第一，刺激的同時無法觀察細胞反應；
第二，無法確定細胞確切的受誘導狀態，經常需要在刺激和取圖之間反覆切換，以獲取最佳的誘導狀態；
第三，由於在AOTF/ZOOM誘導和常規取圖之間切換有明顯的時間延遲，所以該方法對快速反應無能為力；
第四，刺激雷射和取圖雷射都使用XY振鏡，並且使用同樣光路，所以刺激速度和效率都受到限制。Kaede經特定波長的光（其光譜為從紫外線到紫色光）照射時發生螢光光譜轉換，從綠色變為紅色（不可逆轉）
