ppGpp調控

ppGpp調控即高度磷酸化的鳥苷酸分子調控(包括鳥苷酸五磷酸及四磷酸) 是原核生物應對不同環境脅迫壓力，啟動相關生理適應性基因表達調控的“報警”信號分子。作為調控信號分子的ppGpp 具有作用廣泛、時效顯著、微量易分解的特點，在其被認知的初期ppGpp 是放射性自顯影圖上記錄的“魔斑”。隨著研究的深入，ppGpp 對細胞生理狀態的全局性調控機制才漸為人知。

基本介紹

• 中文名：高度磷酸化的鳥苷酸分子
• 外文名：ppGpp
• 環境：不同環境脅迫壓力
• 性質：應急反應

調控機制

ppGpp 作用靶點是RNA 聚合酶。大多數的轉錄調控因子是通過與啟動子或啟動子附近區域的結合調控RNA 聚合酶(RNAP)的轉錄功能。但是,ppGpp 不需要與調控序列或其他轉錄調控因子相互作用, 而是直接與RNAP 結合調控轉錄。曾經認為ppGpp 作用於RNAP 的β, β′, σ70 亞基或β, β′亞基。然而, 晶體結構分析揭示了ppGpp 定位於RNAP 催化中心的附近的次級通道中, 該通道是聚合反應底物NTP 進入的催化中心, 以及轉錄阻滯後新生的RNA 與RNAP 分離的入口。結構和功能與轉錄延伸因子相似, 但是, 序列明顯不同的蛋白DksA, 通過穩定ppGpp 與RNAP的相互作用提高ppGpp 的轉錄調控功能。因此,ppGpp 單獨或與DksA 一起通過抑制或激活不同基因的轉錄, 實施基因表達的調控。ppGpp 轉錄抑制作用的一種可能的機制是ppGpp 與DksA 一起降低RNAP 與DNA形成開放複合體的穩定性, 從而抑制如rRNA 啟動子的轉錄; 另一種可能的機制是RNAP 被ppGpp 誘捕在封閉的複合體中, 不能啟動轉錄。因此,ppGpp 的轉錄抑制可能通過多種因素的協同作用, 在多個水平上發揮調控功能。ppGpp 的轉錄激活作用主要包括直接和間接兩種激活機制模型。直接激活模型認為, ppGpp和DksA 刺激RNAP 與DNA 形成穩定開放複合體的速率, 但確切的機制還不清楚。直接機制也可能通過ppGpp 促進持家Sigma 因子σ70 與RNAP 核心的親和力而激活轉錄。間接激活機制是通過ppGpp 激活胞內由其他Sigma 因子σS、σH、σN和σE指導的基因轉錄。ppGpp 改變持家Sigma因子σ70 與RNAP 核心的親和力, 並提高其他Sigma因子與RNAP 結合的能力, 並由此提出Sigma 競爭模式。由於ppGpp 調控不同基因的表達, 實現其抑制DNA 複製、rRNA 合成、不同功能基因差別表達以及代謝酶的激活或抑制, 並導致細菌細胞生命活動的改變。

不同環境適應性

ppGpp與生長速率調節

嚴謹反應是細菌適應逆境的重要機制之一，當細胞感知外界可利用胺基酸缺乏時，能快速啟動受ppGpp 控制的生長速率調節機制。大腸桿菌野生株細胞中RNA/ 蛋白質及RNA/DNA 的比率，隨著細胞生長速率的變化而不同。當細胞處於快速生長狀態時其比率增大，而當細胞處於慢速生長的培養基時，由於生長速率較低，其比值也處於較低水平。在ppGpp0(ppGpp合成缺陷型)細胞中， RNA/ 蛋白質及RNA/DNA 的比率在快速生長的細胞和慢速生長的細胞中幾乎相同。而且，在慢速生長的ppGpp0 細胞中，RNA 含量增加，說明ppGpp0 細胞喪失生長速率調節功能。當細胞在營養豐富的環境中快速生長時，細胞中各種代謝活動正常運行，積累大量的RNA ；而當營養缺乏時，ppGpp 調節引起嚴謹反應，細胞停止了大部分代謝活動，僅保留維持生存的必需代謝活動，RNA 含量下降。嚴謹型RNA 聚合酶突變是指ppGpp0 細胞的RNA 聚合酶發生突變，從而使細胞恢復了ppGpp調控的表型。在嚴謹型的RNA 聚合酶突變株中，或者在增加了ppGpp 含量的ppGpp0 細胞中，其生長速率調節功能均得到恢復。

ppGpp與溫度適應

通過對微生物生長溫度適應性機制的研究，表明微生物對不同溫度的適應與核糖體及負載tRNA 濃度有密切關係。核糖體相當於溫度感受器，當出現熱激反應時，翻譯的速率瞬間超過了tRNA 的供給速度，引起核糖體A 位出現空位，此時RelA 結合到核糖體上，並由此引起ppGpp 的合成，ppGpp 濃度升高；相反，當出現冷激反應時，翻譯的速率瞬間降低，引起tRNA 濃度升高，導致ppGpp 含量下降。研究ppGpp 與大腸桿菌溫度適應性的關係， 發現大腸桿菌relA 突變株在42℃非致死溫度下耐受性降低，在此基礎上進一步構建了relA 和spoT 基因雙突變株，發現其溫度耐受性進一步降低，這直接說明了大腸桿菌溫度敏感性與細胞內ppGpp 含量的關係，暗示了ppGpp 在大腸桿菌溫度適應性調節上的重要意義。

對Streptococcus thermophilus 菌株熱激反應的研究中，研究者構建了deoD 中斷突變株。取對數期的野生株和突變株進行熱激，然後分析ppGpp 含量的變化，結果表明，野生株在熱激時ppGpp 濃度為熱激前的3 倍，而突變株中ppGpp 的含量幾乎沒有變化。由於deoD 基因是嘌呤代謝途徑中的關鍵酶，因此deoD 中斷株中，ppGpp 的本底水平較高，導致突變株一直處於應對熱激反應的狀態中，所以突變株在熱激反應時更容易存活，而由此也導致了突變株不能在冷激條件下生長。

ppGpp與細菌運動性

鞭毛是細菌的運動部件，其合成需要消耗大量的能量和原料，通過鞭毛實現的運動與細菌對營養源的趨化性相關。在發生嚴謹反應時，ppGpp 會調控鞭毛的合成。研究結果表明，RelA 和SpoT 雙突變株(DrelADspoT) 缺乏鞭毛，幾乎喪失了運動能力；DksA 突變株(DdksA) 運動能力也減弱，說明DksA/ppGpp 正調控鞭毛系統的表達。研究DksA/ppGpp 對大腸桿菌三級鞭毛系統的調控，發現DksA/ppGpp 直接抑制I、II 級鞭毛系統的合成，而間接的抑制III 級鞭毛系統的合成。

ppGpp與細菌的毒力和耐藥性

ppGpp 對生物膜形成、致病菌的侵染力和細胞毒力等多個方面都有影響。致病菌體內ppGpp 的合成能增加其侵染力和致病性，提高其競爭能力，有利於其存活和對生存環境的適應。研究表明，在霍亂弧菌、沙門氏菌、結核桿菌、空腸曲桿菌、土拉弗氏菌等中均發現ppGpp 參與控制其毒力和感染力。對霍亂弧菌的致病性研究表明，relA 基因與其毒力有明顯相關性。當霍亂弧菌感染宿主時，發現菌體內含有高濃度ppGpp，同時毒力因子也處於高濃度中。而relA 基因缺失突變株，喪失了產生毒力因子的能力，說明relA 的確與其致病性有關。空腸曲桿菌是人類病原菌，在其感染腸道上皮細胞時，檢測到其spoT 基因上調，而且該基因與其毒力因子共轉錄。ppGpp 介導的嚴謹反應對於該菌在高氧濃度下存活及對利福平的抗性具有重要作用。此外，ppGpp 還對Listeria monocytogenes 感染宿主時生物膜的形成起到了關鍵作用。對ppGpp 提高細菌抗藥性的機制尚不清晰，可能的原因是RNAP 是許多抗生素的結合位點，而ppGpp 與RNAP 的結合會對抗生素與RNAP 的結合產生競爭抑制。研究致病菌中ppGpp 的調控機制將對致病菌的防治起到一定作用。

ppGpp與微生物群體感應

病原性微生物、共生生物以及黏細菌等，在其生活過程中不僅要面對外界營養缺乏等生存壓力，其與宿主之間的相互關係以及多細胞結構的形成在其生存過程中也顯得至關重要。Pseudomonas aeruginosa 是人類致病菌，其複雜的群體感應系統以及σ 因子RpoS 的表達對許多細胞密度感應依賴性的毒力因子的表達分泌具有重要作用。其群體感應與relA基因的表達有關，relA 的過量表達使rpoS 表達上升。通過構建relA 基因刪除突變株，發現P. aeruginosa 對黑腹果蠅的侵染能力降低。對於營共生生活的根瘤菌(Rhizobium etli)，當氮源缺乏時傾向於形成多細胞的結瘤結構以增加其固氮能力， R. etli 中存在與細菌relA-spoT 基因同源的rsh 基因。rsh 基因的缺失導致R. etli 無法形成結瘤結構，其固氮能力也顯著下降。這充分說明了ppGpp 在根瘤菌群體生活中的作用。在R. etli 中發現很多受ppGpp 調控的靶基因及非編碼小RNA，其中包括與熱激和氧脅迫適應性相關的基因。

ppGpp與極端環境適應性

微生物廣泛分布於自然環境中，一直以來，人類對微生物在極端酸鹼、極端溫度、極端壓力等環境下的生存機制不甚了解。對極端環境適應性和嚴謹反應關係的研究將有助於我們更深刻地理解其適應性機制，並將對揭示生物起源的奧秘，認識地球生態系統的形成及極端微生物資源的開發利用等方面產生重大影響。研究表明，胺基酸缺乏及pH 改變等能誘導胃中的幽門螺旋桿菌合成ppGpp，這有力地說明了ppGpp 在極酸環境中作為信號分子調節毒力基因的表達。深部生物圈中最重要的土桿菌在金屬元素循環中有重要的意義，硫還原土桿菌中Rel 蛋白可以合成和降解ppGpp，在乙酸鹽和氮素缺乏及暴露於氧氣條件下，都可以帶來ppGpp 積累；而rel 基因中斷，則喪失Fe(III) 還原能力。晶片和RT-PCR 結果表明，在靜止生長期，rel 突變造成蛋白質合成相關基因表達上調，而與嚴謹反應相關及Fe(III) 還原等電子傳遞相關的基因表達則下調。Fe是細胞生長必需的離子，控制其攝入的基因是fur 基因，Fe2+-Fur 共同抑制鐵離子代謝相關的基因。當環境中鐵離子濃度變低時， 引起ppGpp 積累，ppGpp 調控fur 基因的表達，加速細胞從環境中攝入所需的鐵離子。

調控的多樣性

在已完成基因組測序的細菌中, 都含有ppGpp 合成酶和水解酶同源基因, 但其組成各不相同。大腸桿菌和所有的β- 和γ- 變形菌以RelA和SpoT 合成ppGpp, SpoT 水解ppGpp。Firmicutes 或放線菌家族成員具有rsh 同源基因和2個以上具有合成活酶活性的基因，其他細菌如藍細菌則含有單一的relA/spoT 同源基因。Firmicutes 家族中各成員的ppGpp 代謝也存在差異。如Bacillus subtilis 中具有一個編碼雙功能的RSH 蛋白的同源基因, 和兩個編碼產物具有合成酶活性的yjbM 和ywaC 基因。rsh 基因缺失突變株可以在正常培養條件下生長, 因此是非必需的; yjbM和ywaC 基因在鹼性條件下誘導表達併合成ppGpp。但在Firmicutes 的另一成員Staphylococcus aureus 中, 也含有1 個rsh 基因和2個編碼ppGpp 合成酶的relP 和relQ 基因。在營養豐富培養條件下, relP 和relQ 基因中1 種或2 種表達產物合成ppGpp, 並通過RSH 水解酶活性維持一定水平的ppGpp。因此, rsh 基因是必需基因不能缺失或失活。

最近, 我們對藍細菌的模式菌株集胞藍細菌PCC6803 中唯一的rsh 基因(syn-rsh)的表達產物在ppGpp 代謝調控中的作用進行了初步研究。互補試驗證明syn-rsh 編碼產物可使大腸桿菌relA-/spoT雙缺失突變株回復野生型表型, 並在細胞中積累一定水平的ppGpp; 在實驗室培養條件下syn-rsh 不能缺失, 在細胞中可檢測到低水平的ppGpp; 胺基酸飢餓可誘導細胞中ppGpp 水平升高並維持在相應水平。表明syn-rsh 表達產物具有合成和水解ppGpp 的雙重功能, 一定水平的ppGpp 是集胞藍細菌PCC6803 在實驗室生長條件下細胞生長所必需的。絲狀固氮藍細菌Anabaena PCC7120 中rsh同源基因具有類似的功能, 並且ppGpp 與缺氮誘導後的固氮作用和異形胞的分化無關。因此, 不同類型的細菌具有不同ppGpp 合成酶和水解酶基因組成以及不同的ppGpp 代謝調控途徑, 甚至相同基因構成的細菌中ppGpp 代謝也存在差異, 表明其代謝的複雜性與多樣性。