體外重組DNA分子是在DNA連線酶的作用下，在含Mg2+、ATP等的連線緩衝液系統中，帶有匹配末端的兩個DNA片段連線而成的。
DNA連線酶,注意事項,連線方法,
DNA連線酶
E.coli DNA連線酶 T4 DNA連線酶
E.coli DNA連線酶
由E.coli基因lig編碼，需煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作為輔助因子。
修復雙鏈DNA上的單鏈缺刻(nick)，用於連線匹配粘端。
T4 DNA連線酶
從T4噬菌體感染的E.coli中分離得到，由T4基因DNA30編碼，需ATP作為輔助因子。
修復雙鏈DNA上的單鏈缺刻(nick)，用於連線匹配粘端；
連線RNA-DNA雜交雙鏈上DNA鏈缺刻；
連線平端雙鏈DNA分子。
1、修復雙鏈DNA上的單鏈缺刻，用於連線匹配粘端。
帶匹配粘端的DNA分子靠近時，自發形成暫時的鹼基配對，利於連線酶把緊鄰的5’-P與3’-OH連線到一起。
不同DNA片斷通過匹配粘端的連線。
同一DNA片斷通過匹配粘端的連線--自身環化。
2、連線RNA-DNA雜交雙鏈中DNA鏈上的缺刻。
3、連線帶平端的雙鏈DNA分子。
注意事項
DNA連線酶不能催化兩單鏈DNA分子連線；
只能連線雙鏈DNA分子的單鏈缺刻(nick)；
不能連線雙鏈中1個或多個核苷酸缺失所致的缺口(gap)。
E.coli DNA連線酶：連線匹配粘端；
T4 DNA連線酶：連線匹配粘端、平端。
最常用的為T4 DNA連線酶。
連線方法
匹配粘端的連線
1）哪些情況下會產生匹配粘端？
同一限制酶切割產生；
同尾酶切割產生。
2）可以用E.coli DNA連線酶、也可以用T4 DNA連線酶。
3）連線效率高。
4）連線後的情況如何？
同一限制酶切割的DNA片段，連線後仍保留該限制酶的識別序列。
兩種同尾酶切割的DNA片段，連線後喪失這兩種限制酶的識別序列。
平端的連線
1）哪些情況下會產生平端？
限制酶切割產生；
RNA逆轉錄合成的cDNA為平端雙鏈；
PCR擴增也能產生，如用Pfu擴增時。
2）只能用T4 DNA連線酶。
3）連線效率低，僅為粘端的1%。
4）連線後的情況如何？
同一限制酶切割的DNA片段，連線後仍保留該限制酶的識別序列，有時還出現另一種新的限制酶識別序列。
不同限制酶切割的DNA片段，連線後喪失這兩種限制酶的識別序列。
提高平端連線效率的方法
加大連線酶用量(10倍於粘端連線，1-2U)；
加大平端DNA片段的濃度；
加入10% PEG 8000；
加入單價陽離子(NaCl)，終濃度150-200 mM。
