離心技術

離心技術，是蛋白質、酶、核酸及細胞亞組分分離的最常用的方法之一，也是生化實驗室中常用的分離、純化或澄清的方法。尤其是超速冷凍離心已經成為研究生物大分子實驗室中的常用技術方法。

基本介紹

• 中文名：離心技術
• 外文名：centrifugation technique
• 作用：分離純化
• 領域：生物學 化學
• 原理：離心力
• 離心技術：lí xīn jì shù 

概況

離心技術是利用物體高速旋轉時產生強大的離心力，使置於旋轉體中的懸浮顆粒發生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達到濃縮或與其他顆粒分離之目的。這裡的懸浮顆粒往往是指製成懸浮狀態的細胞、細胞器、病毒和生物大分子等。離心機轉子高速旋轉時，當懸浮顆粒密度大於周圍介質密度時，顆粒離開軸心方向移動，發生沉降；如果顆粒密度低於周圍介質的密度時，則顆粒朝向軸心方向移動而發生漂浮。常用的離心機有多種類型，一般低速離心機的最高轉速不超過6000rpm，高速離心機在25000rpm以下，超速離心機的最高速度達30000rpm以上。

技術介紹

離心分離是通過離心機的高速運轉，使離心加速度超過重力加速度的成百上千倍，而使沉降速度增加，以加速藥液中雜質沉澱並除去的一種方法。其原理是利用混合液密度差來分離料液，比較適合於分離含難於沉降過濾的細微粒或絮狀物的懸浮液。離心機是一種利用電機高速旋轉產生離心力場，根據不同物質之間密度、形狀、大小等方面的差異，對懸浮液中混合的不同顆粒或乳濁液中密度不同且互不相溶的液體進行分離和提取的儀器設備，廣泛套用於生物學、醫學、化工等領域。利用離心機對樣品進行分離、純化和提取的技術稱為離心分離技術。常用的離心技術包括：沉澱離心、差速離心、密度梯度離心、分析超速離心 、離心淘洗、區帶離心及連續流離心等技術，其中沉澱離心、差速離心和密度梯度離心是實驗室中常用的離心技術。其餘技術均需要特殊的離心機或轉頭。

差速離心法

差速離心是根據顆粒大小和密度不同造成沉降速度(即沉降係數)的差異，通過分級提高離心轉速或高速與低速離心交替進行，使具有不同質量的顆粒樣品(或大分子)從混合液中分批沉降至管底，從而實現分離目的。該方法適用於混合樣品中各沉降係數差別較大的組分之間的分離，更準確地說是沉降係數差別在1至幾個數量級的混合樣品的分離，差別越大，分離效果越好。

差速離心法一般採用固定角轉子，通過較低速度的離心沉澱，最重的顆粒將全部沉到管底。繼續將上清液以更高的轉速沉澱，即可得到次重的顆粒樣品。逐步增加離心轉速，即可分別得到不同重量的樣品顆粒，以達到分離的目的。但以上只是理想狀態，通常每步得到的沉澱並不均一，通常會混有較輕的顆粒。這是因為在離心前各種重量的顆粒均勻分布在溶液中，當開始離心後，所有顆粒都依照自身的沉降速度向管底移動，所以距離管底較近的輕顆粒也會沉到管底而混合到重顆粒之中。通常為了得到較純的顆粒樣品，還需要將沉澱重懸，用相同的轉速再次沉澱。重複幾次之後即可得到大小基本均一的顆粒。但是一般在實際使用中，差速離心通常不用於精細分離。僅用於s值相差1個數量級及以上的2種顆粒的分離，且沉澱不能實現完全回收。

差速離心技術的套用十分普遍，尤其是針對有生物活性的物質，如動植物病毒、各種亞細胞組分(細胞核、葉綠體、線粒體等)，以及核酸和蛋白質等生物大分子的分離、粗提和濃縮。

梯度離心法

密度梯度離心法是使待分離樣品在密度梯度介質中進行離心沉降或沉降平衡，最終分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區帶的分離方法，又稱區帶離心。密度梯度離心不僅可依據樣品顆粒的重量及沉降係數進行分離，還可根據樣品顆粒的密度、形狀等特徵進行分離。密度梯度離心在整個離心過程中只使用一種轉速，中途無需變更實驗參數，而差速離心則需要進行調整轉速、重懸反覆離心等操作。密度梯度離心適宜分離密度有一定差異的樣品，而差速離心則適用於分離混合樣品中各沉降係數差別較大的組分。

密度梯度離心的優點是：分離效果好，可一次性獲得較純的樣品顆粒；適應範圍廣，既可像差速離心法一樣分離具有沉降係數差異的顆粒，又能分離有一定浮力密度差的顆粒；顆粒會懸浮在相應的位置上形成區帶，而不會形成沉澱被擠壓變形，故能最大限度保持樣品的生物活性；樣品處理量大，且可同時處理多個樣品；對溫度變化及加減速引起的擾動不敏感。密度梯度離心法的缺點是：離心時間長、需製備密度梯度介質溶液、對操作者的技能要求較高。密度梯度離心法通常採用吊桶式的水平轉子、區帶轉子及近垂直轉子。

離心前，離心管內先裝入分離介質（如蔗糖、甘油等），使形成連續的或不連續的密度梯度介質，然後加入樣品進行離心，具體又可分為：

速度區帶

離心前，離心管內先裝入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介質，待分離樣品鋪在梯度液的頂部，離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心，利用各顆粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的顆粒處於不同密度的梯度層內，達到彼此分離的目的。本法可分離各種細胞、病毒、染色體、脂蛋白、DNA和RNA等生物樣品。

預製梯度

要求在離心前預先配製管底濃而管頂稀的密度梯度介質，常用介質有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分離樣品一般鋪在梯度液頂上，如需挾在梯度液中間或管底部，則需調節樣品液密度。離心後，不同密度的樣品顆粒到達與自身密度相等的梯度層，即達到等密度的位置而獲得分離。

自成梯度

某些密度介質經過離心後會自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲醯葡萄糖胺經長時間離心後也可產生穩定的梯度。需要離心分離的樣品可和梯度介質先均勻混合，離心開始後，梯度介質由於離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時，可以帶動原來混合的樣品顆粒也發生重新分布，到達與其自身密度相等的梯度層里，即達到等密度的位置而獲得分離。

沉降平衡

根據被分離物質的浮力密度差別進行分離，所用的介質起始密度約等於被分離物質的密度，介質在離心過程中形成密度梯度，被分離物質沉降或上浮到達與之密度相等的介質區域中停留並形成區帶。

離心工具

離心機(centrifuge)是實施離心技術的裝置。離心機的種類很多，按照使用目的，可兩類，即製備型離心機和分析型離心機。前者主要用於分離生物材料，每次分離樣品的容量比較大，後者則主要用於研究純品大分子物質，包括某些顆粒體如核蛋白體等物質的性質，每次分析的樣品容量很小，根據待測物質在離心場中的行為(可用離心機中的光學系統連續地監測)，能推斷其純度、形狀和相對分子質量等性質。兩類離心機由於用途不同，故其主要結構也有差異。通常所使用的離心機根據轉子轉速大小的不同可分為普通離心機、高速離心機和超速離心機三類。

技術原理

介紹

將樣品放入離心機轉頭的離心管內，離心機驅動時，樣品液就隨離心管做勻速圓周運動，於是就產生了一向外的離心力。由於不同顆粒的質量、密度、大小及形狀等彼此各不相同，在同一固定大小的離心場中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互間的分離。

離心力

溶液中的固相顆粒做圓周運動時產生一個向外離心力，其定義為：

F = mω2r

式中：

F 為離心力的強度； m 為沉降顆粒的有效質量；

ω 為離心轉子轉動的角速度，其單位為rad/s；

r 為離心半徑(cm)，即轉子中心軸到沉降顆粒之間的距離。

很顯然，離心力隨著轉速和顆粒質量的提高而加大，而隨著離心半徑的減小而降低。離心力通常以相對離心力Fcf 表示，即離心力F 的大小相對於地球引力(G)的多少倍，單位為g，其計算公式如下：

Fcf = 1.119×105(h)2r×g

可以看出，在同一轉速下，由於f 的不同，Fcf相差會很大，實際套用時一般取平均值。在離心實驗的報告中，Fcf、r 平均、離心時間t 和液相介質等條件都應表示出來，因為它們都與樣品的沉降速度有直接的聯繫。顯然Fcf是一個只與離心機相關的參數，而與樣品並無直接的關係。

速度與係數

一個顆粒要沉降，它必須置換出位於它下方等體積的溶液，這隻有當顆粒的質量大於被置換出的液體的質量時才能通過離心的手段達到，否則，在離心過程中顆粒將發生向上漂浮，而不是下沉。當顆粒在運動時，不論方向如何，它都要穿過溶劑分子，所產生的摩擦力總是與顆粒運動的方向相反。

摩擦力的大小與顆粒的運動速度成正比，並且受顆粒的大小、形狀及介質性質的影響：式中：

f 為顆粒在濟劑中的摩擦係數．與顆粒的大小、形狀及介質性質相關；

v 為顆粒的沉降速度。

由於離心力的存在，顆粒將加速運動直到摩擦力與離心力相等。在這種情況下，顆粒所受到的淨作用力為零，顆粒將以最大速度運動。

式中 Mp 和M s 分別為顆粒的質量及等體積的溶劑的質量。

上式中的Mp 和M s 很難確定，為了建立分子大小與沉降係數之間的關係，引入了沉降係數這一新的概念。沉降係數定義為沉降速度與離心力的比率或單位離心場中顆粒的沉降速度，它以svedberg單位計算，1S=1×10-13 s。例如，核糖核酸酶A 的沉降係數為1．85×10-13 s，即可記作1．85S。

近年來，在生物化學、分子生物學及生物工程等書刊文獻中，對於某些大分子化合物，當它們的詳細結構和分子量不很清楚時，常常用沉降係數這個概念去描述它們的大小。如核糖體RNA(rRNA)有30 s 亞基和50s 亞基，這裡的s 就是沉降係數，現在多地用於生物大分子的分類，特別是核酸。

類型

最大速度方法

(1)移動界面超速離心法

含幾個組分的樣品在足夠高的離心場中離心時，每種顆粒都達到其最大沉降速度，這時樣品開始分離。離心管的上層逐漸形成透明的上清液，並形成對應於樣品各組分的一系列濃度界面，界面的移動相對於每種組分來說是特徵的。

雖然利用這種方法不一定能實現組分的純化分離，但可以通過監測界面的移動來測定各組分的沉降速度。要想實現組分間的分離，必須在所需樣品沉降之後停止離心過程。沉積的樣品再懸浮到新的溶劑中，並以較低的速度離心使大顆粒的污染物沉降，而被純化的樣品留在溶液中，經過反覆多次地離心才能得到純的樣品，這種方法就叫差示沉降離心法，它對細胞組分間的分離非常有用。也可以通過逐漸增大轉速的方法實現不同組分間的分離。

(2)移動區帶超速離心法

差示離心法離心前各組分均勻分布在整個溶液中，所以分離一般不理想，而移動區帶超速離心法是一種密度梯度(Dens 心Gradient)離心技術，在離心之前離心管中溶液的密度不同(從上到下密度增大)，梯度介質中最大密度應小於樣品物質的最小密度，其特點是物質的分離取決於樣品物質顆粒的質量．即樣品物質的沉降係數，而不是取決於樣品物質的密度，因而適合於分離密度相近而大小和形狀不同的物質，這屬於一種非平衡態分離法。當樣品物質輕輕地鋪在密度梯度介質的液面上，起動離心機，在離心力的作用下，一定時間後便形成不同物質的區帶。當繼續離心時每個區帶會逐一達到管底，所以，在沉降最快的區帶到達管底之前要停止離心，並將每個區帶分部收集。最常用的製備密度梯度的化合物有蔗糖、甘油、氯化銫和硫酸銫等。

等密度方法

等密度離心法也叫沉降平衡法。所謂等密度是指樣品密度與介質的密度相等，實際上是在梯度密度介質中進行的。該技術的特點是沉降分離與樣品物質的大小和形狀無關，而取決於樣品物質的密度。這種方法非常類似於電泳中的PH 梯度等電聚焦方法，在離心時，顆粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移動到與自身的密度相同的溶劑梯度中為止，其結果是依樣品物質密度的不同在梯度溶劑中形成一個個區帶。

在實驗方法上可以採用預先製備密度梯度溶液的方法，一般先製備兩種儲備液，它們的濃度決定最終所形成梯度溶液的極限。可以通過分步減小密度，從離心管底部到上部逐漸加液的方式形成不連續梯度溶液，也可以通過一個梯度混合器產生連續梯度密度。儲備液一般使用兩種密度的蔗糖溶液或兩種密度的氯化銫溶液來製備。樣品一般鋪在溶液的表面，然後開始離心。

在實驗方法上也可以採用平衡密度梯度法，在這種離心法中，介質的梯度不是預先配製，而是在離心過程中，由於離心力的作用而逐漸形成。樣品物質和氯化銫的濃鹽溶液充分混合均勻，離心開始之後，銫鹽由於離心力的作用，自離心管口至離心管底形成連續遞增的密度梯度。生物樣品中不同組分物質在離心過程中沉降或上浮以尋找與自身密度相同的溶液密度梯度區帶，不同的物質最終到達相應的區帶，從而實現分離。這種方法依賴於在離心場的作用下低分子量的銫鹽密度梯度的形成，一般需要長時間的離心(2~3天)。顯然，樣品物質的密度應介於介質梯度中最大和最小密度之間，否則，樣品將沉到離心管的底部或漂浮到溶液的頂層。

實現方法

穿刺法

這是方便而又理想的部分收集方法。用一根金屬空心針從離心管底刺人管內，不同區帶內的組分自下而上地先後從針管內分別流出，然後用部分收集器分別收集。

取代法

在離心管口加一個帶有收集導管的塞子，塞子上同時裝有一根輸液導管插入離心管的管底，從輸液管中注入高密度的離心介質．其密度高於離心管中所形成的最大密度。當取代液不斷注入時離心管中的溶液逐漸上升，並不斷從收集導管中流出，然後用部分收集器分別收集。