基本介紹
介紹,製作方法,製備,實驗方法,操作步驟,
介紹
雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特徵。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠細胞與小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特徵是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有b細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才具有持續增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特徵的細胞，這種雜種細胞叫做雜交瘤細胞。
製作方法
製備
1） 瘤細胞培養（無特殊要求）
骨髓瘤細胞呈懸浮或輕微附著形式生長， 如附著性生長的細胞多時， 用吸管輕輕吹打或輕輕 叩擊培養容器即可分離下來。 通常要維持細胞於指數生長期 （細胞培養時間為 15~20 小時） ，每 3~5 天取細胞 0.2~1ml 移入到 10ml 新培養液中， 其最大細胞密度不能超過 5×10 ~10 /ml。 一般使用含有高糖的 DMEM 培養液，並補加有 pH 的穩定劑 HEPES。
2）免疫小鼠和脾細胞的製備
免疫小鼠：取 6~8 周齡 Balb/C 雌鼠，基礎免疫 2 周，靜脈再加強免疫一次，3~5 天后用於融合。
脾細胞製備： 1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。
3．把脾臟置於已消毒的 90~100 目不鏽鋼網或尼龍紗網中。
4．在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養液沖洗，令細胞通 過紗網，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內注入 3 ml 無血清培養液，反覆抽吸數次方 法獲取細胞，再製成細胞懸液亦可。
5．把細胞懸液注入 50ml 離心管中，加 10~20ml 培養液，輕輕吹打數次，室溫中置 5 分鐘。
6．離心（800~1000 轉/分）計數，備用。
3）飼細胞的製備：常用小鼠胸腺細胞或小鼠的腹腔細胞
飼細胞的製備：
小鼠腹腔細胞製備方法：
1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。
2．切開腹部皮膚剝向兩側，暴露出腹壁。
3．用無菌 7 號針頭注射器，吸取 3ml 無血清培養液。
4．用小鑷夾起腹壁，注入 3ml 無血清培養液，用手反覆輕輕揉腹壁，再反覆抽吸 3~5 次。
5．收集末次吸得的細胞，注入 50ml 的離心管中，再加 20ml 無血清培養液，用吸管漂洗一 次。
6．離心，去上清，用含血清培養基調節細胞濃度為 2×105/ml，接種入培養板中，24 孔板 每孔加 0.1ml。
4）細胞融合
1．稱取 136.1 mg H，38.8 mg T。
2．依次溶解在 100ml 雙蒸水中，H 難溶，可加溫 50~80℃促溶。
[A 貯備液製備 貯備液製備]
1．稱取 17.6mg A 到 90ml 雙蒸水中。
2．滴加 1M NaOH 溶液並不斷搖動，直至完全溶解，再滴加等量 1M HCl 溶液，恢復 pH 在 7.0 左右。 3．補足雙蒸水至最終體積 100ml。
4．0.22 微米濾膜濾過除菌，分裝，-20℃冰櫃貯存。使用時，每 100ml 培養液（含血清）加 1ml HT 貯備液和 1ml A 貯備液。 1.0×10-2 M 1.6×10-3 M 4.0×10-5 M PEG（誘導劑）的製備（30%~50%）
1．取分子量 1000 的 PEG 高壓蒸氣滅菌（6.8 公斤，15 分鐘）
2．56℃水浴中融化後，37℃水浴中溫浴。
3．取無血清培養液 37℃水浴中溫浴（單獨）
4．配 40%濃度時，用刻度吸管吸 0.4ml PEG 和 0.6ml 無血清培養液混合、37℃水中溫育備 用。
細胞準備
1．收集骨髓瘤細胞，用無血清培養液洗 3 次（37℃） ，計數活力細胞（不少於 90%） 。
融合方法一：
1．將 1ml 40%的 PEG 液一滴滴加入到細胞團中，在 60 秒內加完，同時並不斷輕微轉動離 心管或用手指輕彈離心管。
2．在不斷轉動離心管中加 1ml 無血清培養液，60 秒鐘內加完。
3．於 5 分鐘內慢慢加完 20ml 無血清培養基。此時細胞對機械損傷非常敏感。
4．離心（800 轉/分，8 分鐘） ，去上清，用完全培養液 10ml 懸浮，輕輕混勻。
5．取 96 孔板，每孔加 50 微升。
6．取等體積細胞懸液，向另一 96 孔板中加 50 微升。
7．送入 5%CO2 溫箱中 37℃培養，24 小時後更換成 HAT 選擇性培養液。
方法二：
1．加 0.2ml 43%的 PEG 於離心管中。
2．用預先消毒的細玻璃針伸入管中輕輕攪動細胞團。
3．室溫中置 2 分鐘。
4．加入 10ml 完全培養液。
5．800 轉/分離心 5 分鐘。
6． 2 倍 HAT 培養液培養懸浮細胞， 24 孔板， 用 取 每孔中加 0.5ml， 96 孔板每孔中加 0.1ml。 另 7．5%CO2 溫箱，37℃，一周后第一次更換培養液，培養板中預先接種有飼養細胞，加 2× HAT 選擇培養液與原等量培養液混合後，即成為 1×的 HAT 培養基。
融合後細胞培養
1．融合後 7~10 天用 HAT 培養液變數換液，以後每隔 2~3 天半量換液一次。
2．兩周后可改用 HT 培養液半量換液，或仍用 HAT 培養液。
3．2~3 周后出現雜交細胞集落，細胞個大，圓且透明。
4．待集落增殖生長至 1/3 孔時，應進行抗體檢測。
1．稱 1g 瓊脂粉，加入到 100ml 雙蒸水中，高壓蒸氣滅菌，4℃冰櫃保存。
2．使用前，1%的瓊脂和 2×的 DMEM 培養液在 45℃水浴中分別溫浴。
3．二者等體積混合後，立即加入 1.5×107 小鼠脾細胞，混勻。
4．立即到入平皿中，每平皿（直徑 10cm）加 10ml，室溫中置 15 分鐘。
5．另取雜交瘤細胞懸液和 0.5%瓊脂等體積混合（0.25%瓊脂） ，加 2ml 到預先鋪有底層瓊脂 的瓶皿內。
6．CO2 溫箱培養。
[有限稀釋法]
2．收集細胞、計數陽性培養細胞。
3．細胞懸液調至 5~10 個細胞/ml。
4．96 孔板中每孔加 0.1ml。
5．CO2 溫箱培養一周后，半量換液，繼續培養。
6．適時檢測每孔培養上清，挑選呈陽性培養孔的細胞繼續進行有限稀釋，直至確信孔中細 胞為單克隆為止。
7．進行擴大培養。
5）抗體的檢測 ） 常用方法：免疫螢光試驗、放射免疫試驗（RIA） ，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。 胞的篩選
實驗方法
ELISA法所需試劑配置
包被緩衝液(pH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝液):
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸餾水至 1000ml
洗滌緩衝液(pH7.4 0.15M PBS):
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tween-20 0.05% 0.5ml
加蒸餾水至 1000ml
操作步驟
包被抗原：pH9.6碳酸鹽緩衝液（CBS）稀釋抗原，加入到酶標板中，100μL/孔，37℃ 2小時或4℃過夜。甩乾，洗滌3次，3分鐘/次。
封閉（血清或脫脂奶粉）：此步有時用，有時不用。
加被檢樣品（一抗），100μL/孔，37℃ 半小時，甩乾，洗滌3次，3分鐘/次。
加酶標抗體（二抗），100μL/孔，37℃ 半小時，甩乾，洗滌3次，3分鐘/次。
顯色： 5ml的顯色A液,5ml的顯色B液，100μL/孔，37 ℃反應10～20分鐘。
