雙啟動子表達載體

雙啟動子表達載體

雙啟動子表達載體是基因工程中表達載體的一種,在雙啟動子表達載體中,啟動子轉錄方向可以是同向的,也可以是反向的。在同向轉錄時,由於上游啟動子轉錄會穿過下游啟動子,這樣就使得下游啟動子的轉錄受到一定的影響,使下游轉錄水平下降。如果在兩個啟動子中間插入一個轉錄終止子,上游啟動子對下游啟動子的影響會減少,下游啟動子的表達量會有明顯提高。當兩個啟動子轉錄方向相反時,基因表達可能會被轉錄形成的反義RNA抑制。這時插入轉錄終止子將會消除這種不良作用。

基本介紹

  • 中文名:雙啟動子表達載體
  • 外文名:Dual promoter expression vector
  • 運用領域:基因工程
  • 本質:表達載體
  • 特點:啟動子轉錄方向可以是同向或反向
  • 其他載體:誘導型表達載體
基因工程表達載體,表達載體應該具備的條件,雙啟動子表達載體用於構建基因疫苗,

基因工程表達載體

基因工程技術當中,克隆載體主要用來目的基因的數量擴增。當需要獲得目的基因的表達產物時,則需要使用基因表達載體。在生物體內,完整的基因包括啟動子區域、編碼區域、終止區域,因此表達載體將外源基因在宿主細胞中表達成蛋白質,其必要條件是:①需要很強的啟動子,並能被宿主細胞的RNA聚合酶識別並啟動轉錄,這樣保證基因大量表達;②需要很強的終止子,使得RNA聚合酶轉錄目的基因的序列而不是其他無關的序列;③目的基因的編碼區必須具有翻譯起始密碼子ATG,原核表達載體還需要SD序列(圖1)。
圖1圖1
根據重組表達載體產生的蛋白存在形式,將表達載體分為融合型載體和非融合型載體。就一般情況而言,實驗者是希望得到非融合蛋白。但是融合蛋白質有其優勢,一方面,載體上的融合標籤序列使得蛋白純化變得容易,另一方面,融合序列可使蛋白的翻譯效率提高,基因產物較為穩定。最後,融合蛋白可通過化學方法裂解成非融合蛋白。
基因表達載體有很多類型,如誘導型表達載體、反義基因表達載體、組織特異性表達載體、分泌型表達載體、雙啟動子表達載體等。

表達載體應該具備的條件

①能自我複製並能帶動插入的外源基因同步複製。
②具有合適的限制性內切酶位點。在載體上單一的限制性內切酶位點越多越好,這樣可以將不同限制性內切酶切割後的外源DNA片段方便地插入載體。
③具有合適的篩選標記,方便選擇克隆子,如抗藥性基因等。
④在細胞內拷貝數要多,這樣才能使外源基因得以擴增。
⑤載體的分子質量要小。這樣可以容納較大的外源DNA插入片段。載體分子質量太大將影響重組體或載體本身的轉化效率。
⑥在細胞內穩定性高,這樣可以保證重組體穩定傳代而不易丟失。
⑦基因載體必須是安全的,不應含有對受體細胞有害的基因,而且不會轉入除受體細胞以外的其他生物的細胞,尤其是人的細胞。

雙啟動子表達載體用於構建基因疫苗

基因疫苗常用真核表達質粒作為載體。構建過程符合真核表達載體構建的一般原理。真核表達載體的數量和種類繁多,而且新的功能更強的載體不斷湧現,其中pcDNA載體系列是套用最多、背景比較清楚的真核表達載體。常用的有pcDNA—3.1、pcDNA—3.1一E、pcDNA3.1/Zeo(+/一)、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pRc/RSV等多種。
這類載體用人巨細胞病毒早期啟動子(CMV)和猴空泡病毒早期啟動子(SV40)作為增強子——啟動子元件。這類元件來源於病毒基因組,在很多真核細胞中都有很強的促進轉錄的作用。也有用來自RNA病毒如HIV、AMV、RSV和MMLV等反轉錄病毒的長末端重複序列(LTR)。這些病毒源的增強子一啟動子元件中,以CMV和LTR的啟動效率比較高。
也有用金屬硫蛋白基因啟動子(mMT)、肽鏈延伸因子啟動子(EF)、熱激蛋白啟動子(HSP)、肌酸激酶啟動子(MCK)和β一肌動蛋白啟動子等細胞源的啟動子一增強子元件。這類元件多數是常規表達量高的持家基因順式調控原件,為真核細胞本身所固有。這類元件可單獨使用,但更多是和病毒源啟動子構建雙啟動子表達載體。
在雙啟動子表達載體中,啟動子轉錄方向可以是同向的,也可以是反向的。在同向轉錄時,由於上游啟動子轉錄會穿過下游啟動子,這樣就使得下游啟動子的轉錄受到一定的影響,使下游轉錄水平下降。如果在兩個啟動子中間插入一個轉錄終止子,上游啟動子對下游啟動子的影響會減少,下游啟動子的表達量會有明顯提高。當兩個啟動子轉錄方向相反時,基因表達可能會被轉錄形成的反義RNA抑制。這時插入轉錄終止子將會消除這種不良作用。由RNA聚合酶Ⅱ轉錄出的RNA在3’端還有一個約100~200bp的poly(A),該結構對維持成熟mRNA的穩定性有十分重要的作用。當表達載體缺少poly(A)序列時,外源基因的表達水平可能下降10倍以上。
由於外源基因轉入真核細胞後的表達水平受多種因素影響,包括重組質粒拷貝數、轉錄效率、mRNA加工過程及其穩定性、翻譯效率、蛋白質加工效率等。能夠高效表達某一抗原基因的表達載體對另一抗原基因而言可能並不合適。因此,必須根據實際情況,選擇合適的表達調控元件,構建合適的表達載體。

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