基本介紹
- 中文名：雙元載體
- 外文名：binary vector
- 舉例：雙元TI載體、pc22、PLZ03等
- 篩選標記：抗卡納黴素、慶大黴素、鏈黴素等
- 質粒的大小：通常大於10kb
- 發展策略：高容量、多基因組、定點整合
早期的雙元載體,雙元載體的研究進展,
早期的雙元載體
1、複製起始位點
有許多載體上攜帶有一個廣譜複製起始位點如pCB302、pBINZI含有pRKZ序列，pGreen
含有PS等，因此能夠在所有的革蘭氏陰性菌包括大腸桿菌和農桿菌中複製，但是它們的拷貝數很低，不利於遺傳操作。而增加一個多拷貝數的複製起始位點可使這些載體產生更多的拷貝，利用pBR322的ColEI，pCB200O系列載體擁有非常高的拷貝數。除了psa，pGreen載體也利用Co1EI來獲得高拷貝數。含有農桿菌複製起始位點pRi的pC22和pCGN1547在農桿菌中則只有一個拷貝。
2、大腸桿菌篩選標記
常見的大腸桿菌篩選標記主要包括抗卡納黴素(如pCB302、pBIN22、pGreen)、慶大黴素、四環素、大觀黴素(如pBECKS2000)、鏈黴素(pBECKSZO00)等。
3、質粒的大小
常見的質粒通常大於10kb，如pCB2002大小為11kb，pBN19大小為12kb，pJJ1881大小為26kb，用於大片段轉化的pYLTAC大小為22kb，使得多克隆位點的選擇受到較大限制，基因操作不方便，且質粒載體在體內的重組效率和其大小成反比。隨著人們對於轉化DNA大片段的需要，要儘可能的減小載體的大小。將BPIN19載體上非T一DNA的部分去掉了約skb的片段，同時保留了雙元載體的關鍵成分得到的pCB3OZ僅有3.skb，是文獻報導的最小的雙元載體。不同的複製起始位點大小有很大差別，因而通過採用小的複製起始位點可以減小載體的大小，如質粒pPZP上的pvsl(Sta和r即)比pRK和pRi小。
4.雙元載體的T一DNA
T一DNA的邊界序列來源於不同的Ti質粒，但是它們的序列相差不大。其他則採用的人工合成的T一DNA邊界序列，如pBECKS2000。早期的雙元載體通常是將篩選標記放在T一DNA的右邊界，後來發現在T一DNA轉移過程中右邊界在前，因此，有可能在轉化過程中被某種因素所阻斷從而產生只含有篩選標記基因的假陽性轉化體出現。通過T一DNA內部結構的改變形成了不同的載體系統，從而達到不同的目的，如用於複製起始位點啟動子和增強子分析，激活突變庫創製，插入導致的基因失活以及轉座突變體庫創製等，這些載體的T一DNA內部結構有著較大差別。
CPB2002載體含有一個GUS基因序列，在其上游為一多克隆位點，可用於啟動子的分析。根據擬南芥葉片和根的生物晶片的信息，將一些大量表達的基因上游啟動子序列克隆到該載體中構建了一系列用於啟動子分析的載體。在pCBZOO3的多克隆位點上游加入一個鹽誘導表達啟動子Sa了入可以研究在高鹽存在的條件下目的基因的生物學功能。pGreen的多克隆位點含有18個限制性內切酶切位點，可根據不同的需要選擇性插入所需要的篩選標記基因、報告基因等，為提高轉化效率和減少假陽性轉化體的出現，可以在T一DNA兩端同時使用不同的植物篩選標記。pBIN19的衍生載體NP陽Kl在T一NDA的左右邊界各含有一個植物篩選標記，與用一種篩選方法相比明顯減少假陽性率，轉入的基因可以得到更穩定的表達。
雙元載體的研究進展
(一)大片段DNA的轉化載體
生物對外界脅迫的抵抗或自身代謝的調控都是由一系列的基因共同作用的結果，要研究這些基因的功能，就需要一種載體系統能將這些自然或者體外合成的基因串轉化到植物基因組中以便於研究。許多對農業生產非常重要的基因已經被定位到具體的染色體上，但是對於大多數農作物而言都無法用T一DNA插入突變的方法得到飽和的突變體群來完成這些基因的定位，使用大的DNA片段進行基因互補轉化能夠有效地完成對這些目的基因的精確定位。基於基因圖譜的克隆技術常被用來克隆新基因，目的基因與標記基因間相對位置的精確定位取決於對於突變體表型的精確衡量和後代數目的準確檢測，每一個突變位點的精確定位通常需要1000個後代植株，如果目的片段位於一個低重組區域，該基因的定位將更加困難。
(二)多個基因的轉化
農桿菌介導的轉基因對於單基因的研究非常常見，但是一些重要的生物學特徵如抗逆性和一些複雜的代謝途徑常常是多個基因共同作用的結果。我們可以通過：一、不同轉基因植株的雜交;二、按照順序依次轉化；三、攜帶不同的基因片段的載體同時轉化；四、將不同的外源基因在體外連線到同一個轉基因載體上等方法實現多基因的轉化。很明顯前兩種方法需時長，第三種方法結果的偶然性很強。第四種方法，需要找到一種方便快捷的外源基因連線方法。原理非常相似:都採用了Cre/loxP點特異性重組。
(三)植物篩選標記可除型載體
