鈣蛋白酶

鈣蛋白酶是一種降解蛋白的酶，主要是對肌肉各種蛋白的降解。calpain把肌原纖維中的蛋白進行降解，故而肌纖維被降解，骨骼肌的剪下力降低，肉的嫩度提高，是對肉品質起重要作用的一種依賴鈣離子的蛋白酶。calpain活性受肌細胞中鈣離子的濃度影響，鈣離子可以激活此蛋白，根據激活此種蛋白所需的鈣離子濃度calpain分為u-calpain（微摩爾級）和m-calpain（毫摩爾級）。

基本介紹

• 中文名：鈣蛋白酶
• 外文名：Calpain
• 作用：對肌肉各種蛋白的降解
• 關鍵字：鈣蛋白酶；骨骼肌
• 所屬領域：分子生物學

鈣蛋白酶資料

概述

目前多種動物的這兩種鈣蛋白酶的cDNA已被克隆，提取mRNA並使其表達，這方面好多分子生物學實驗已經做了。主要是看此蛋白酶是怎樣的對蛋白質進行調控，但到目前為止沒有對calpain的作用機理作出明確並權威的結論來，大部分是猜測和推理。有對於這方面研究感興趣的朋友，或者已經開始研究的朋友來共同研討，本人也是關注沒有多久，但已經確定做這方面的課題了。

摘 要：大量的研究表明鈣蛋白酶在蛋白質降解方面起著重要作用，為了提高骨骼肌的生長速度和家畜宰後的肉品質，人們對鈣蛋白酶系統的作用機理進行了大量研究，發現鈣蛋白酶系統中的多種鈣蛋白酶與骨骼肌生長及宰後嫩化有很大的相關性。本文就鈣蛋白酶在骨骼肌生長及其嫩化中的作用的研究作一概述。

關鍵字：鈣蛋白酶；骨骼肌；生長；嫩化

骨骼肌生長速度最終取決於骨骼肌細胞的數量、肌肉蛋白合成速度和降解速度。激素注射、飼料添加劑的使用、營養狀況和飼養管理等都能通過調節以上3個基本因素中的1、2個或3個而影響整體蛋白質的沉積速度，從而影響肌肉生長速度。骨骼肌蛋白降解速度相對降低或蛋白合成速度相對升高都會導致肌肉生長速度的增加，也會提高攝入營養物質的肌肉轉化率。依賴鈣的鈣蛋白酶途徑是骨骼肌蛋白降解的一種非常重要的途徑。肌原纖維蛋白質降解的第1步是肌原纖維解裝配成肌絲，這一步可能是肌原纖維蛋白質降解過程中限速的一步。大量的研究表明鈣蛋白酶系統參與這一解裝配過程。近年的研究表明，calpain是細胞質中主要的蛋白水解酶，在肌原纖維蛋白降解中起著重要作用。肌肉增長和宰後嫩度的變化與蛋白質水解程度密切相關。因此鈣蛋白酶的活性會影響畜禽肌肉增長和肉的嫩度，並對肉質產生一定的影響。

結構

鈣蛋白酶（EC3，4，22，17）是細胞內依鈣中性半胱氨酸內肽酶。在體內，通過Ca2+激活及自溶而表現出蛋白水解酶的活性，並通過鈣蛋白酶抑制活化的鈣蛋白酶活性。鈣蛋白酶系統的主要作用對象是細胞骨架蛋白、蛋白激酶和磷酸酶以及激素受體。廣泛存在的鈣蛋白酶有鈣蛋白酶1（u-calpain）、鈣蛋白酶2（m-calpain），還有鈣蛋白酶3（p94）。前兩者都由2個亞基組成，分子量相近，但兩者表現最高活性所需的Ca2+濃度不同。u-calpain所需的Ca2+為1～12umoL/L，而m-calpain所需的鈣離子為250～750u moL/L。它們的小亞基相同，而大亞基是兩個相關基因的產物，兩種大亞基之間存在一定的免疫交叉反應。有功能的鈣蛋白酶是由大亞基（催化區，80kd）和小亞基（調節區，30kd）組成，小亞基是單個基因的產物，而大亞基則是不同基因的產物。不同來源的鈣蛋白酶cDNA序列發現其大亞基由4個結構域組成，其中結構域Ⅱ是表現水解活性的關鍵部位，它約占大亞基胺基酸殘基數的35%左右；結構域Ⅳ，位於羧基端，占胺基酸殘基數的20%，是鈣離子結合部位；結構域I和結構域Ⅲ分別占胺基酸殘基的10%和35%，可能起活性調節作用。calpain3（p94）也是一個與肌肉的嫩度密切相關的蛋白酶。

活性調節

激活調節

細胞中鈣蛋白酶活性受到Ca2+和鈣蛋白酶抑制蛋白（calpastatin）、鈣蛋白酶激活蛋白（calpain activator）的調節，其中calpain activator是calpain的正調節因子。提高Ca2+濃度，鈣蛋白酶的活性增強，Ca2+濃度進一步提高將導致構象變化而表現蛋白水解酶活性。當鈣蛋白酶被Ca2+激活後，如果附近有鈣蛋白酶抑制蛋白存在，將迅速與之結合，抑制蛋白酶活性，從而保證鈣蛋白酶對底物只進行局部的特定位點的水解。由於激活鈣蛋白酶所需的Ca2+濃度大於1umol/L，而胞內的Ca2+濃度為0.2～0.8umol/L，不足以激活鈣蛋白酶。在活體中，鈣蛋白酶如何被激活一直是一個令人困惑的問題。目前發現的鈣蛋白酶激活蛋白有2種，一種是UK114，另一種是ACBP-醯基輔酶A結合蛋白，前者是calpain1的激活因子，後者是calpain2的激活因子。目前牛羊的UK114的cDNA序列已經得到克隆。calpain是鈣依賴蛋白酶，只有在Ca2+激活的狀態下才具有活性，當calpain的大小亞基相結合時，它不具有活性。在表現水解活性時，大致發生以下4個過程的變化：calpain大小亞基的分離；小亞基的自溶，30kd亞基迅速降解為17kd；大亞基自溶，80kd轉化成78kd再變成76kd；calpain構象發生變化而表現蛋白水解酶活性；calpain受激活後呈自溶狀態，從而表現活性。calpain受濃度調控，高Ca2+濃度能加速calpain的活化。除了Ca2+濃度，calpain的活性還受離子強度、pH、底物等因素的影響。

抑制調節

calpastatin是高效的、專一的calpain活性抑制劑，並且在大多數組織中，calpastain的濃度可抑制calpain的活性。當calpain被Ca2+ 激活，如果附近有calpastatin存在，將迅速與之結合，影響u-calpain的自溶穩定性，抑制calpain活性，從而保證calpain對底物只進行局部的特定位點的水解（Roman等，1999）。鈣蛋白酶抑制蛋白與鈣蛋白酶結合後，降低calpain的活性，可能起到防止鈣蛋白酶被隨機激活的作用。一些抑制劑可以以共價鍵的方式與酶的巰基牢固結合，使酶失去活性，如碘乙醯胺、碘乙酸、E-64等可對calpain發生不可逆抑制作用。根據這些特性，人工合成一些多肽以抑制calpain的活性，如leupeptin、三肽氯甲基酮，它們在P2位點都含有亮氨酸，對calpain發生競爭抑制作用。

作用

骨骼肌生長

骨骼肌鈣蛋白酶存在於肌細胞內部，在Z線中濃度最高。快速萎縮肌肉中鈣蛋白酶活性是正常肌肉的數倍，它的一個特徵是Z線的降解，而肌動蛋白和肌球蛋白保持完整。肌原纖維蛋白質降解的第1步必須是肌原纖維解裝配成肌絲。大量研究表明，鈣蛋白酶系統參與這一解裝配過程。鈣蛋白酶引發肌原纖維蛋白質降解的可能機制如下：鈣蛋白酶使Z線（使細肌絲固著於肌原纖維）和肌聯蛋白、伴肌動蛋白（使粗肌絲和細肌絲固著於肌原纖維）降解，肌原纖維釋放出肌絲。細肌絲的肌原蛋白和原肌球蛋白以及粗肌絲的C-蛋白降解，粗肌絲和細肌絲分別解離出肌球蛋白和肌動蛋白，釋放出的粗肌絲和細肌絲可與母體或其他肌原纖維重新裝配，也可被胞質蛋白酶或溶酶體組織蛋白酶降解成胺基酸。肌原纖維的殘留部分功能完整，收縮力量減弱。

研究表明，calpain的作用可能僅在細胞內蛋白質的降解過程中起調節作用，而並非整個降解過程的直接參與者。推測calpain可能通過對肌原纖維蛋白進行特異的局部降解而對其結構、功能進行調控。calpain導致肌肉降解可分為兩步：首先攻擊肌原纖維的肌節（兩個相鄰Z盤之間的一段肌原纖維）部位，釋放肌絲降解為小片段，然後被溶酶體所捕獲進一步降解。calpain主要集中於Z盤，因此認為，降解從此處開始。但近期研究發現，calpain首先水解的是N2線。calpain參與骨架蛋白的降解是蛋白質水解過程中的限速步驟。楊曉靜等試驗發現，對豬注射重組生長激素後，背最長肌calpain3mRNA的表達有上升趨勢，半腱肌中calpain3mRNA的相對豐度顯著上升，在肌肉增長的過程中calpain3也可能參與蛋白的降解。

肌肉嫩化

肉的嫩度主要決定於肌纖維、肌節長度、肌內脂肪和結締組織等。哺乳動物肌纖維在胚胎形成過程中受到MyoD家族的調控，MyoD家族包括MyoDI、肌細胞生成素（myogenin，MYOD）、myf-5和myf-6，它們通過調節肌肉分化階段特異性蛋白的表達來參與肌細胞的分化。MyoD基因控制啟動成肌細胞融合和肌纖維形成，在肌肉分化過程中起關鍵作用。Esson Gustavsson(1993)研究發現肌纖維的數量在出生時就決定了，生後肌纖維生長只限於肌纖維長度和橫切面積的增長；同時發現肌肉品質受到肌纖維類型和直徑的影響，用肌球蛋白ATP酶可將肌纖維分為3種類型，即1、IIA和IIB型。紅肌（即I型纖維）較白肌(即Ⅱ型纖維)的纖維含量多、肌纖維細、肌肉較嫩。肌原纖維的狀態對嫩度具有決定性的作用，肌原纖維越碎裂、越舒張，剪下力越低、嫩度越好（陳代文等，2001）。嫩化是屍僵發生後一定時間內，肌纖維碎裂，肌肉重新變軟，嫩度增加的過程。鈣蛋白酶系統在細胞內參與機體生長與代謝過程，還在肌原纖維更新和宰後嫩化中扮演重要角色。calpain表達減少以及calpastatin表達量的增加，都會導致肌肉蛋白水解率及宰後肉嫩度的下降，這表明calpain水解作用是導致肉嫩化的主要因素。在宰後嫩化的過程中m-calpain的活性幾乎不變，而u-calpain的活性顯著下降，鈣蛋白酶活性下降是其發揮水解作用的體現。由於活體宰後Ca2+濃度可以激活u-calpain而不能激活m-calpain，大量研究表明在肌肉的熟化過程中u-calpain的活性增高，含量急劇下降，因此u-calpam被認為是改善肉質嫩度的候選基因。Morgan等（1993）和Koohmaraie等（1996）認為u-calpain是肉嫩化的基本酶類。Ilian等（2001）研究發現肉的嫩度與u-calpain的活性具有相關性。calpastatin可抑制鈣蛋白酶的活性，降低蛋白質水解，但鈣蛋白酶系統調節肌肉嫩化的具體機制還不甚清楚。

結論

家畜整體蛋白質的增加受兩個過程制約：整體蛋白質合成和降解，控制蛋白質降解和合成可以提高肌肉生長速度。許多研究表明，calpain在肌原纖維蛋白的降解，特別是在早期肌肉轉化過程中起著重要的調節作用，抑制其活性有可能抑制蛋白質的降解從而提高肌肉生長。但是現有的抑制劑除抑制calpain的活性外還或多或少地抑制其他蛋白酶的活性，缺乏專一性。而calpastatin是高效的、十分專一的calpain活性抑制蛋白，因此可以通過基因調控技術提高其在肌肉組織中的表達來抑制calpain的活性，從而達到提高肌肉生長的目的。我們可以重組DNA技術超表達鈣蛋白酶抑制蛋白或有缺陷的鈣蛋白酶，然後研製細胞系，鈣蛋白酶抑制蛋白或鈣蛋白酶的超表達均可能在其中被肌肉特異啟動子啟動，從而控制肌原纖維蛋白質降解以加快蛋白質積累。肉的嫩化與calpain的活性有關，因此可以通過激活calpain或降低calpastadn活性的方式提高肉的嫩度，改善肉質，也就是說可以在家畜生長階段提高calpastadn的活性來抑制calpain的活性，促進蛋白質的沉積，提高骨骼肌的生長速度，在屠宰前提高calpain的活性以增加骨骼肌的嫩度。但總的來說鈣蛋白酶系統的具體調控機理還不很清楚，還需要利用分子生物學等技術手段進行深入的研究。