基本介紹
- 中文名：透射電子顯微鏡樣品製備技術
- 性質：儘可能保持材料的結構
- 大分子：蛋白質、核酸
- 類型：製備程式與光學顯微鏡的切片
樣品製備的方法隨生物材料的類型以及研究目的而各有不同。對生物組織和細胞等，一般多用超薄切片技術，將大尺寸材料製成適當大小的超薄切片，並且利用電子染色、細胞化學、免疫標記及放射自顯影等方法顯示各種超微結構、各種化學物質的部位及其變化。對生物大分子（蛋白質、核酸）、細菌、病毒和分離的細胞器等顆粒材料,常用投影、負染色等技術以提高反差,顯示顆粒的形態和微細結構。此外還有以冷凍固定為基礎的冷凍斷裂──冰凍蝕刻、冷凍置換、冷凍乾燥等技術。
超薄切片術將小塊生物材料，用液態樹脂單體浸透和包埋，並固化成塑膠塊，後用超薄切片機切成厚度為500埃左右,甚至只有50埃的超薄切片。超薄切片的製備程式與光學顯微鏡的切片程式類似，但各步驟的要求以及所使用的試劑和操作方法有很大差別。
固定選用適宜的物理或化學的方法迅速殺死組織和細胞,力求保持組織和細胞的正常結構,並使其中各種物質的變化儘可能減小。固定能提高細胞承受包埋、切片、染色以及電子束轟擊的能力。主要固定方法有：
①快速冷凍，用致冷劑（如液氮、液體氟利昂、液體丙烷等）或其他方法使生物材料急劇冷凍，使組織和細胞中的水只能凍結成體積極小的冰晶甚至無定形的冰──玻璃態。這樣，細胞結構不致被冰晶破壞，生物大分子可保持天然構型，酶及抗原等能保存其生物活性，可溶性化學成分（如小分子有機物和無機離子）也不致流失或移位。用冷凍的組織塊，可進行切片、冷凍斷裂、冷凍乾燥和冷凍置換等處理。用此法固定的樣品既可提供組織、細胞結構的形態學信息，又可提供相關的細胞化學信息。②化學固定，固定劑有凝聚型和非凝聚型兩種，前者如光學顯微術中常用的乙醇、二氯化汞等，此法常使大多數蛋白質凝聚成固體,結構發生重大變化,常導致細胞的細微結構出現畸變。非凝聚型固定劑包括戊二醛、丙烯醛和甲醛等醛類固定劑和四氧化鋨，四氧化鉬等，適用於電子顯微。它們對蛋白質有較強的交聯作用,可以穩定大部分蛋白質而不使之凝聚,避免了過分的結構畸變。它們與細胞蛋白質有較強的化學親和力，固定處理後，固定劑成為被固定的蛋白質的一部分。如用含有重金屬元素的固定劑四氧化鋨（也是良好的電子染色劑）進行固定，因為鋨與蛋白質結合，增強了散射電子的能力，提高了細胞結構的反差。採用一種以上固定劑的多重固定方法，如採用戊二醛和四氧化鋨的雙固定法，能較有效地減少細胞成分的損失。此外，固定劑溶液的濃度、pH及所用的緩衝劑類型、滲透壓、固定時間和溫度等對固定效果都有不同程度的影響。
固定操作方法通常是先將材料切成 1立方毫米左右小塊，浸在固定液中，保持一定溫度（通常為4℃）,進行一定時間的固定反應。取材操作要以儘可能快的速度進行，以減少組織自溶作用造成的結構破壞。對某些難以固定的特殊組織，如腦、脊髓等，最好使用血管灌注方法固定，即通過血管向組織內灌注固定液，使固定液在組織發生缺氧症或解剖造成損傷之前，快速而均勻地滲透到組織的所有部分。灌注固定的效果比浸沒固定好得多。
脫水化學固定後，將材料浸於乙醇、丙酮等有機溶劑中以除去組織的游離水。為避免組織收縮，所用溶劑需從低濃度逐步提高到純有機溶劑，逐級脫水。
浸透脫水之後，用適當的樹脂單體與硬化劑的混合物即包埋劑，逐步替換組織塊中的脫水劑，直至樹脂均勻地浸透到細胞結構的一切空隙中。
包埋浸透之後,將組織塊放於模具中,注入樹脂單體與硬化劑等混合物，通過加熱等方法使樹脂聚合成堅硬的固體。用作包埋劑的樹脂有甲基丙烯酸酯、聚酯和環氧樹脂等。最廣泛使用的是某些類型的環氧樹脂，如618樹脂、Epon812、Araldite和 Spurr等商品樹脂。它們具有良好的維持樣品特性、低收縮率和較強的耐電子轟擊能力等優點。
切片製備超薄切片要使用特製超薄切片機（大多是根據精密機械推進或金屬熱膨脹推進原理製成）和特殊的切片刀（用斷裂的玻璃板製成的玻璃刀或用天然金剛石研磨而成的金剛石刀）。先將樹脂包埋塊中含有生物材料的部分，用刀片在立體顯微鏡下修整成細小的金字塔形,再用超薄切片機切成厚度適中（500埃左右）的超薄片，切片應依次相互聯接形成切片帶。切片帶漂浮於裝在切片機上的水槽中的水面上。
通過裝置在切片機上的解剖顯微鏡，監控切片過程。用螢光燈照射水面上的切片，並根據由此產生的干涉光顏色來判斷切片的實際厚度（見表）。
切片通常用敷有薄的支持膜的特製金屬載網，從水面上撈取。快速冷凍固定的生物材料，可用冷凍超薄切片裝置製成切片。用醛類或冷凍方法固定的組織，可通過超薄切片術與生物化學技術、免疫技術等結合使用,進行超微結構水平上的蛋白質、核酸、酶及抗原等生物活性物質的定位甚至定量研究。這就是電鏡細胞化學技術（見細胞化學）和電鏡免疫細胞化學技術。
染色電子顯微鏡主要是依賴散射電子成像，為了增強細胞結構的電子反差，需要對切片進行染色。染色是依據各種細胞結構與染色劑（重金屬鹽）結合的選擇性，而形成不同的對電子散射能力，從而產生藉以區別各種結構的反差。電子染色方法分塊染色和切片染色兩種：①塊染色法，在脫水劑中加入染色劑，在脫水過程中對組織塊進行電子染色。②切片染色法，最常用，即將載有切片的金屬載網漂浮或浸沒在染色液中染色。也可使用有微處理機控制的染色機進行自動化染色。一般切片染色所使用的染色劑為金屬鈾鹽和鉛鹽的雙重染色。為顯示某種特殊結構，則可採用與該結構有特異性結合的選擇性染色劑。
冷凍置換法用有機溶劑（如丙酮、乙醚等）在低溫條件下（通常，-80～-90℃），緩慢地置換冷凍固定的小塊組織中的冰（“惰性脫水”），這樣可減少常規方法脫水過程中有機溶劑對組織中化學組分的抽取。然後再按常規方法進行樹脂包埋、超薄切片和染色等。用冷凍置換法，可以很好地保存快速變化過程中物質的狀態和非常脆弱的超微結構以及細胞內某些化學組分。
電鏡放射自顯影技術用超薄切片術與放射性同位素標記技術相結合的電鏡放射自顯影術(見同位素技術)可獲得同位素標記的化合物在組織細胞記憶體在部位，以及在代謝過程中物質的合成、分解、轉運及分泌的信息。
負染色和投影技術 研究分散的顆粒狀生物材料,為增強其反差，常採用的方法。
負染色研究以蛋白質為主要成分的顆粒狀材料的最常用方法。以某些在電子束轟擊下穩定而又不與蛋白質相結合的重金屬鹽類作為負染色劑，使之在支持膜上將顆粒材料包圍，形成具有高電子散射能力的背景，襯托出低電子散射能力的顆粒的形態細節。其所成的電子顯微像的反差與常規電子染色相反，即暗的背景和亮的顆粒形態的所謂陰性反差。負染色方法簡便，所獲得的顆粒的電子顯微圖像反差強,解析度也高於超薄切片,可廣泛用於研究蛋白質分子、細菌鞭毛、蛋白質結晶，以及生物膜及分離的細胞的細微結構，特別適用於蛋白質大分子及病毒顆粒結構的三維重建研究。常用的負染色劑有醋酸鈾、磷鎢酸鈉或磷鎢酸鉀、 矽鎢酸、 銅酸銨及甲酸鈾等。用液滴法或噴霧法將顆粒材料的懸液加在載網的支持膜上，然後滴加負染色劑溶液。或將顆粒的懸液與負染色劑按一定濃度混合滴加或噴撒到支持膜上，吸去多餘液體，待乾燥後，即可用電鏡觀察。樣品顆粒在支持膜上的均勻分散是成功的關鍵之一。染色劑溶液的pH則是成功的另一關鍵。一般染色劑的pH應在中性偏酸範圍（pH 5～7）,但對不同種類的顆粒材料和染色劑，最適pH也不盡相同。
投影 在真空蒸發器的高真空腔中,加熱某些金屬至熔化後，金屬以細小顆粒沿直線方向蒸發出來。當金屬微粒以一定入射角噴鍍在載有顆粒材料的載網支持膜表面上時,顆粒向蒸發源的一面即被鍍上一層金屬薄膜,而背蒸發源的一面及附近區域形成無金屬沉積的“陰影”，並且由於各部位散射電子能力存在著差別，這樣就能構成具有強烈反差和立體感的電子顯微圖像。常用於投影的蒸發材料，有金、 鉻、 鉑、鈀以及鉑-銥、鉑-鈀、鉑-碳等金屬或合金。此外，還可利用電子槍投影裝置使鎢、鉭等高熔點金屬以極微細顆粒蒸發，從而獲得高解析度投影。
蛋白質展膜技術用電子顯微鏡研究核酸分子常用的方法。某些鹼性球蛋白，如細胞色素c,可以在低濃度鹽溶液或蒸餾水表面展成單分子層，在展開過程中，能為蛋白質的鹼性胺基酸側鏈基團所吸附的、帶負電荷的核酸分子同時展開成完整的線狀分子。然後，用帶有支持膜（有機膜或碳膜）的載網撈起這些蛋白質──核酸展膜,並用染色或金屬投影法提高核酸分子的反差,可在電鏡下直接觀察核酸分子的形態、DNA的雙螺旋結構,並可通過分子長度的測量來計算核酸分子量。
冷凍斷裂和冰凍蝕刻技術研究細胞超微結構，特別是生物膜結構的一種獨特的樣品製備技術。利用快速冷凍方法固定的生物組織塊具有剛性和脆性。在對其施加外力後，組織即在結構上結合最薄弱的部位發生“脆性斷裂”，這就是“冷凍斷裂”。對於生物膜，斷裂沿膜內部疏水區發生，從而暴露出膜內部結構。利用投影和復型技術，製備斷裂面的復型,然後將組織腐蝕掉,並用載網撈起復型膜，就可用電鏡來研究組織斷裂表面所顯示的細胞的或生物膜內部超微結構。在高於 10毫米汞柱真空度和-100℃溫度下，冷凍組織的斷裂表面上的冰升華為水蒸汽，而使原表面高度下降，即謂之“冰凍蝕刻”。由於組織各部分結構的含水量不同，凍的升華造成各部分結構的表面高度下降程度有差異，因此冰凍蝕刻的斷裂表面的投影、復型所顯示的斷裂表面形態具有很強的立體感。冷凍斷裂和冰凍蝕刻技術，為細胞超微結構，特別是關於細胞聯接、細胞融合、細胞分化以及生物膜的通透性的研究提供了許多重要信息。也為流行的生物膜結構模型，即“流動鑲嵌模型”的研究提供了有利的證據。
參考書目
洪濤：《生物醫學超微結構與電子顯微鏡技術》，科學出版社，北京，1980。
