基本介紹
- 中文名：質粒抽提
- 外文名：Plasmid Extraction
- 條件：RT
- 方法：利用酶/弱去污劑部分裂解細菌
- 結果：以得到相對純淨的質粒
實驗原理,原理,溶液Ⅰ,溶液Ⅱ,溶液Ⅲ,質粒抽提步驟,抽提竅門,注意事項,
實驗原理
提取質粒DNA的方法有很多種，從提取產量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取，從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取，從具體操作方法分可以分為鹼裂解法、煮沸法、牙籤法等，各種不同的方法各有其優缺點，根據不同的實驗目的可以採用合適的提取方法。詳細內容請參考《分子克隆實驗指南》。另外，復旦大學生化與分子生物學實驗室一篇文章，提供了質粒提取機理的詳細解說。
鹼裂解法
人們使用鹼與SDS裂解法從E. coli（大腸桿菌）中分離製備質粒DNA已有30多年的歷史。將細菌懸浮液暴露於高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清中。
儘管鹼性溶劑使鹼基配對完全破壞，閉環的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。只要OH-處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型複合物，後者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用K+取代Na+時，複合物會從溶液中有效地沉澱下來，離心除去變性劑後，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
在SDS存在的條件下，鹼水解是一項非常靈活的技術，它對E. coli的所有菌株都適用，並且其細菌培養物的體積可以從1-500mL以上。
煮沸法
煮沸法是將細菌懸浮於含有Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶的緩衝液中，然後加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細菌外壁，還有助於解開DNA鏈的鹼基配對，並使蛋白質和染色體DNA變性。但是。閉環質粒DNA鏈彼此不會分離，這是因為它們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構。當溫度下降後，閉環DNA的鹼基又各就各位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體DNA和蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。煮沸裂解法對於小於15kb的小質粒很有效，可用於提取步至lmL（小量製備），多至250mL（大量製備）菌液的質粒，並且對大多數的大腸桿菌菌株都適用。但對於那些經變性劑、溶菌酶及加熱處理後能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株，則不推薦使用該法。這是因為碳水化合物很難除去，會抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大，在CsCl-溴化乙錠梯度離心中會使超螺旋質粒DNA帶變得模糊不清。大腸桿菌菌株HBl01及其衍生菌株（其中包括TGl）能產生大量的碳水化合物，不適於用煮沸法裂解。
質粒小提試劑盒
用於大腸桿菌中質粒DNA的小量提取，它結合了最佳化的鹼裂解法，以及方便快捷的矽膜離心技術，具有高效，快捷的特點，能在30min內完成全部操作。利用試劑盒能從1-5mL過夜培養的大腸桿菌菌液中純化得到10-40μg高質量的質粒DNA（OD260/OD280=1.7-1.9），此質粒DNA可直接用於DNA序列分析，各種酶促反應，PCR以及部分細胞系的轉染等。
原理
其中用到三種溶液以及矽酸纖維膜（超濾柱）。 溶液Ⅰ：50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA，pH 8.0；溶液Ⅱ：0.2 N NaOH / 1%SDS； 溶液Ⅲ：3 M 醋酸鉀/ 2 M 醋酸/75%酒精。
溶液Ⅰ
溶液Ⅱ
此步為鹼處理。其中NaOH主要是為了溶解細胞，釋放DNA，因為在強鹼性的情況下，細胞膜發生了從雙層膜結構向微囊結構的變化。SDS與NaOH聯用，其目的是為了增強NaOH的強鹼性，同時SDS作為陰離子表面活性劑破壞脂雙層膜。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的鹼性條件下基因組DNA片斷也會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DNA會斷裂。
溶液Ⅲ
溶液III的作用是沉澱蛋白和中和反應。其中醋酸鉀是為了使鉀離子置換SDS中的鈉離子而形成了PDS，因為十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子後變成了十二烷基硫酸鉀 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同時一個SDS分子平均結合兩個胺基酸，鉀鈉離子置換所產生的大量沉澱自然就將絕大部分蛋白質沉澱了。2 M的醋酸是為了中和NaOH。基因組DNA一旦發生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被 PDS共沉澱了，所以鹼處理的時間要短，而且不得激烈振盪，不然最後得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。75%酒精主要是為了清洗鹽份和抑制Dnase；同時溶液III的強酸性也是為了使DNA更好地結合在矽酸纖維膜上
質粒抽提步驟
Ⅰ.使用質粒提取試劑盒提取質粒時請參考具體試劑盒的操作說明。如Omega公司的E.Z.N.A.® Plasmid Mini Kit I, Q(capless) Spin（質粒提取盒）。
Ⅱ.鹼裂解手提法：此方法適用於小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用於酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：
2：37℃振盪培養過夜。
3：取1.5ml菌體於Ep管(離心管)，以4000rpm離心3min，棄上清液。
4：加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。
5：加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），輕輕翻轉混勻，置於冰浴5min.
6：加入0.15m1預冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），輕輕翻轉混勻，置於冰浴5min.
7：以10，000rpm離心20min，取上清液於另一新Ep管
8：加入等體積的異戊醇，混勻後靜置10min.
9：以10，000rpm離心20min，棄上清。
10：用70%乙醇0.5ml洗滌一次，抽乾所有液體。
抽提竅門
1：加溶液II（裂解液）後，操作一定要溫和，劇烈混合會導致基因組DNA污染。
2：洗脫時60℃溫育（Ellution Buffer）洗脫緩衝液或去離子水效果更好。
3：若質粒提取含量低，可增加菌液樣或換用ArtMedia Plasmid Culture，其比LB培養基質粒得量高
4：菌體應徹底懸浮 ， 如果沒有徹底懸浮菌體，則殘留的菌體團塊在溶液 II 加入後，變成難以完全裂解的團塊。這個團塊在溶液 III 加入後，會有一部分蛋白質繼續存在於溶液中，成為蛋白質殘留的最大根源。
5：加入溶液 II 後，混勻，體系最好能立即變得清澈。體系如果變得清澈了，馬上加入溶液 III 中和。
6：中和的操作 ，在 1.5ml 離心管中加入溶液 III 後，先顛倒兩次，使管底朝上，用指頭彈擊管底數次，再顛倒混勻。效果非常好。
注意事項
降低RNA殘留的方法
RNA 的去除，首先是使用 RNase 消化。在溶液 I 中加入高濃度的 RNase A (100ug/ml)，或者用含 25ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的質粒，都可以降低 RNA 殘留，但都不能徹底去除。幸運的是，RNA 的殘留並不影響酶切等最常用的用途。如果想徹底去除 RNA 殘留，可以用試劑盒，或者使用對 4 個鹼基都作用的 RNase。
降低gDNA殘留的方法
gDNA 的殘留問題，必須在抽提過程中解決，否則，就只能用膠回收方法處理了。gDNA 越大，越難於復性，也就越容易被去除；所以，一定要儘可能不打斷 gDNA。裂解體系越粘稠，gDNA 越容易被扯斷；操作手法越重，gDNA 也越容易被打斷。溫和操作，使用相對過剩的試劑，是降低 gDNA 殘留的最好方法。
降低蛋白質殘留的方法
蛋白質的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白質複合物的形成。雖然將中和後的體系置於 4C 一段時間，可以形成更多的該不溶複合物，從而使蛋白質殘留更少，但實踐證明這樣做並不是必須的，除非是大量抽提。只要加入溶液 I 後的懸浮，加入溶液 II 後的裂解及加入溶液 III 後的中和是均勻徹底的，蛋白質的殘留就應該在可以滿足實驗要求的水平；而只有溶液的用量足夠，甚至過剩，才能確保裂解和中和是徹底的。當然，試劑盒及苯酚的使用，是可以更進一步降低蛋白質的殘留的。
降低質粒Nick的方法
細菌收穫時間，菌株的選擇，抽提操作的劇烈程度是影響 Nick 的三個主要因素。細菌收穫過早，質粒還在複製過程中，Nick 的比例較高；過晚，細菌開始死亡，雜質會比較多。如果使用胞內酶含量很高的宿主菌，會出現較高比例的 Nick。加入溶液 II 及加入溶液 III 的混勻操作，也可以導致一些 Nick，但影響不會比前兩者大。
降低變性超螺旋的方法
理論上，用鹼裂解法抽提質粒，變性超螺旋的出現是不可避免的。之所以大家沒有非常在意，一是因為它的存在似乎對酶反應沒有任何影響，二是因為它的含量並不一定高到被用電泳觀察到。抽提使用相對過剩的溶液，在加入溶液 II 後，體系能在 1 分鐘內變澄清，再快速加入溶液 III，這樣基本上能將變性超螺旋的出現控制在電泳看不見的水平。 (變性超螺旋電泳時比正常超螺旋跑得快一點點。)
關於質粒多聚體
QIAGEN 提供了一個沒有進一步解釋的觀察：從有些宿主菌中抽提質粒 (pTZ19)，電泳能發現很多條帶；但使用單酶切後，仍然變成一條帶，大小正好是線性單質粒的大小。根據這一觀察，可以推理如下：那些大的條帶(質粒多聚體)是由完整的單質粒“粘”在一起形成的，而不是我的一條鏈與你的一條鏈復性在一起；第二，這種“粘”只是部分的，否則酶切會有問題；第三，這種“粘”是脆弱的，線性後的剛性足以打破它。如果是這樣，質粒多聚體的出現與質粒的結構及序列有關，可以不管它(也管不了)，因為它不影響酶切，或者說，即使質粒多聚體切不動，也不會影響太大。總之，碰到這種情況，不要簡單地認為有問題，而是應該一步一步往下做，但一定要做完一步，檢測一次，看一看結果與預期的吻合程度。
提高得率的方法
