蛋白酶K是一種從白色念 珠菌分離出來的強力蛋白溶解酶，具有很高 的比活性，是DNA提取的關鍵試劑。該酶 在較廣的pH範圍（4〜12.5)內及高溫 (50〜70°C)均有活性，用於質粒或基因組 DNA、RNA的分離。在DNA提取中，主 要作用是酶解與核酸結合的組蛋白，使 DNA游離在溶液中，隨後用不同方法進行 抽提，除去雜質，收集DNA。EDTA等螯 合劑或SDS等去垢劑均不能使之失活。蛋 白酶K貯存液一般為10mg/ml或20mg/ml。 貯存於一20°C。蛋白酶K溶液為無色透明， 如出現沉澱就不能再使用。（陸惠玲）
基本介紹
- 中文名：蛋白酶k
- 定義：一種枯草蛋白酶類的高活性蛋白酶
- 作用：生物樣品中蛋白質的一般降解
- 解釋：絲氨酸蛋白酶
- 分子量：28,900道爾頓（28.9kDa）
簡介,抑制劑,作用,保存方法,套用,
簡介
從林伯氏白色念球菌（tritirachium album limber）中純化得到。據資料顯示：該酶有兩個Ca2+結合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理並無直接關係。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由於出現遠程的結構變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩餘活性通常已足以降解在一般情況下污染酸製品的蛋白質。所以，蛋白酶k消化過程中通常加入EDTA（以抑制依賴於Mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩衝液。在消化完畢後、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l,以鰲合Ca2+。
蛋白酶K，是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族胺基酸和芳香族胺基酸的羧基端肽鍵。此酶經純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由於蛋白酶K在尿素和SDS中穩定，還具有降解天然蛋白質的能力，因而它套用很廣泛，包括製備脈衝電泳的染色體DNA，蛋白質印跡以及去除DNA和RNA製備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH範圍內（pH 4-12.5）均有活性。
推薦反應緩衝液：50mMTris-HCl(pH7.5),10mM CaCl2 。
蛋白酶K配製標準：20mg/ml蛋白酶K配製標準（proteinase K）：將200mg的蛋白酶K加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然後分裝成小份貯存於-20℃。
抑制劑
蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶，因此可以用苯甲基磺醯氟抑制其作用，苯甲基磺醯氟是一種絲氨酸蛋白酶的抑制劑。
作用
值得注意的是，蛋白酶K在原位雜交技術中通常用於雜交前的處理,它具有消化包圍靶DNA蛋白質的作用,以增加探針與靶核酸結合的機會,提高雜交信號.但蛋白酶K的濃度過高、消化時間過長或孵育溫度過高時,都會對細胞的結構有一定的破壞,導致組織切片的脫落,細胞核的消失,從而影響雜交結果.EDTA緩衝液可以替代蛋白酶K的作用,解決上述出現的問題,並能達到理想的染色效果.
保存方法
保存：保存在－20℃冰櫃里，避免反覆凍融，有效保證12月。
孵育溫度為55至65℃，理想孵育溫度為58℃，孵育時間為15分鐘至48小時；理想孵育時間為2小時。
