《肉與肉製品 氯黴素含量的測定(GB/T 9695.32-2009)》制定過程中參考了“歐盟食品分析方法CY3.6”。本標準由全國肉禽蛋製品標準化技術委員會提出並歸口。本標準起草單位：中國肉類食品綜合研究中心、中國商業聯合會商業標準中心、武漢市疾病預防控制中心、江陰市產品質量監督所、廈門市疾病預防控制中心。本標準主要起草人：宋永青、趙榕、梁高道、郭文萍、吳東雷、駱和東、靳曉蕾、劉振宇。
基本介紹
- 中文名：肉與肉製品 氯黴素含量的測定
- 外文名：Meat and Meat Products-Determination of Chloramphenicol Content
- 發布單位：國家質監總局、標準化管理委員會
- 實施日期：2009-05-01
範圍,規範性引用檔案,氣相色譜-質譜法(確證法),原理,試劑和材料,儀器設備,分析步驟,結果計算,精密度,附 錄,氯黴素標準物質衍生物的總離子流,氯黴素標準物質衍生物的質譜圖,氯黴素標準物質衍生物的選擇離子質譜圖,
範圍
本標準規定了畜禽肉中氯黴素的測定方法。
本標準適用於畜禽肉中氯黴素的測定。
本標準檢出限：氣相色譜-質譜法，檢出限為0.2ug/kg；酶聯免疫法為0.05ug/kg。
規範性引用檔案
下列檔案中的條款通過GB/T9695本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用檔案，其隨後所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用於本部分，然而，鼓勵根據本部分達成協定的各方研究是否可使用這些檔案的最新版本。凡是不注日期的引用檔案，其最新版本適用於本部分。
GB/T6682 分析實驗室用水規格和試驗方法(GB/T6682— 2008，ISO3696：1987，MOD)。
GB/T9695.19 肉與肉製品 取樣方法。
氣相色譜-質譜法(確證法)
原理
樣品中氯黴素用乙酸乙酯提取，脂肪用正己烷去除，經C18淨化，BSTFA+TMCS(99+1）衍生後，用NCI源選擇印m/z為466的特徵離子為目標離子，在SIM模式下進行GC-MS測定。
試劑和材料
若無特別說明，所用試劑均為分析純，所用水應符合GB/T6682的要求。
- 氯黴素：標準品，純度≥ 99%。
- 甲醇：色譜純。
- 三氯甲烷
- 正己烷：色譜純。
- 乙酸乙酯。
- 無水硫酸鈉。
- 氯化鈉。
- N、O-雙三甲基矽烷三氟乙醯胺(BSTFΛ )。
- 三甲基氯矽烷(TMCS)。
- 丙酮：色譜純。
- 甲苯。
- 甲醇溶液：甲醇+水=2+8。
- 氯化鈉溶液(40g/L)：稱取4.00g氯化鈉，用水溶解，定容至100mL。
- 甲醇一氯化鈉溶液：量取甲醇溶液20mL、氯化鈉溶液80mL，混勻。
- 混合衍生劑：N、O-雙三甲基矽烷dg 氟乙醯胺+三甲基氯矽烷=99+1。
- 氯黴素標準儲備溶液(c=0.1mg/mL)：稱取氯黴素標準品0.01g(精確至0.0001g)，用丙酮溶解並定容至100mL。儲備液貯存在4℃ 冰櫃中，可使用兩個月。
- 氯黴素標準工作溶液：根據試驗需要，用丙酮稀釋標準儲備溶液，配成適當濃度的標準工作溶液。
儀器設備
實驗室常規設備及下列儀器。
- 氣相色譜-質譜聯用儀(GC- MS)。
- 分析天平：可準確稱重至0.0001g。
- 分析天平：可準確稱重至0.01g。
- 離心機：5500r/min。
- 渦旋儀。
- 同相萃取裝置。
- 均質器。
- 振盪器。
- 機械設備：用於試樣的均質。包括：絞肉機、斬拌機等肉類組織粉碎機。
- 氮吹儀。
- 具塞離心管：50mL、10mL。
- C18固相萃取柱或相當者：200mg，3mL。
分析步驟
試樣液製備
試樣的製備
按GB/T9695.19規定的方法取樣。至少取有代表性的試樣200g，使用適當的機械設備將試樣均質。均質後的試樣儘快分析，否則，應密封低溫貯存，防止試樣變質或成分發生變化。貯存的試樣在啟用時，應重新混勻。
提取
稱取10g樣品(精確至0.01g)置於50mL具塞離心管中，加人少量無水硫酸鈉和30mL乙酸乙酯均質1min，以5000r/min離心5min後，用吸管吸出上層乙酸乙酯於濃縮瓶中，殘渣再加入乙酸乙酯15mL重複提取樣品，合併提取液。提取液在50℃ 水浴中旋轉蒸發，除去乙酸乙酯，加入l mL甲醇-氯化鈉溶液和4mL正己烷，充分振搖後，轉移至10mL具塞離心管中，用1mL甲醇-氯化鈉溶液清洗濃縮瓶，合併清洗液於10mL具塞離心管中。渦旋0.5min，經3000r/min離心3min後，用吸管吸去正己烷，加人4mL正己烷重複上述操作。然後在離心管中加人4mI乙酸乙酯，渦旋1min，經3000r/min離心3min後，用吸管吸出乙酸乙酯，加入4mL乙酸乙酯重複上述操作，合併乙酸乙酯於濃縮瓶中，在50℃ 水浴中旋轉濃縮至近乾，用5mL水溶解殘渣。
淨化
依次用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇、5mL水活化C18固相萃取柱，然後加人上述步驟得到的提取液，加5mL甲醇+水淋洗色譜柱，用25mL甲醇洗脫於濃縮瓶中，洗脫液在50℃ 下濃縮至近乾。用100uL甲醇溶解殘渣，並轉移至10mL具塞離心管中，再用甲醇沖洗濃縮瓶，合併洗液，於50℃ 下用氮氣吹乾。
衍生化
於吹乾的試樣殘渣中加人100uL甲苯和100uL混合衍生劑，蓋緊塞後，渦旋混勻1min，60℃ 下反應30min，然後在50℃ 下用氮氣吹乾，加入1mL正己烷溶解殘渣。
標準工作液製備
配製好的標準工作液按“衍生化”步驟進行操作。
空白液製備
除不稱取試樣外，均按“試樣液製備”步驟進行操作。
測定
氣相色譜-質譜法測定條件
- 色譜柱：DB-5MS(30m× 0.25mm× 0.25um)石英毛細管柱或相當者；
- 載氣：氦氣，純度≥99.999%；
- 流速：1，65mL/min；
- 進樣口溫度：250℃ ；
- 進樣量：1uL；
- 進樣方式：無分流(保持1min)進樣；
- 柱溫程式：初始55℃ ，保持1min，以25℃ /min速度升至280℃ ，保持6min；
- NCI源：70eV；
- 離子源溫度：150℃ ；
- 接口溫度：280℃ ；
- 溶劑延遲：7min；
- 反應氣：甲烷，純度≥99.99%；
- 選擇離子檢測：
保留時問/min | 目標物 | 檢測離子m/z |
12.58 | CΛP—TMS | 466，468，376，378 |
定性測定
進行樣品測定時，如果檢出的色譜峰保留時間與標準樣品相一致，並且在扣除背景後的樣品質譜圖中，所選擇的離子均出現，而且所選擇的離子比與標準樣品衍生物的離子比相一致(各相關離子比在相關標準品的1O%之內)，則可判斷樣品中存在氯黴素。
定量測定
吸取1uL衍生的試樣液、標準液或空白液注入氣相色譜-質譜聯用儀中，以m/z 466為定量離子，標準工作液中氯黴素的濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪製標準曲線。根據試樣液的峰面積，從標準曲線上查出溶液中對應的氯黴素濃度值。用標準工作曲線對試樣進行定量，樣品溶液中氯黴素衍生物的回響值均應在儀器測定的線性範圍內。
在上述色譜條件下，氯黴素衍生物的參考保留時問為12.58min。氯黴素標準物質衍生物總離子流圖和質譜圖以及氯黴素標準物質衍生物選擇離子質譜圖參見附錄中的圖A.1、圖A.2、圖A.3。
平行試驗
按以上步驟，對同一試樣進行平行試驗測定。
結果計算
按式(1)計算樣品中氯黴素的含量：
式中：
X 一試樣中氯黴素的含量，單位為微克每千克(ug/kg)；
c —從標準工作曲線上查得試樣液中氯黴素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；
c0一從標準工作曲線上查得空白液中氯黴素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；
V 一試樣定容體積，單位為毫升(mL)；
m 一稱取試樣的質量，單位為克(g)。
結果取算術平均值，保留三位有效數字。
精密度
在重複性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%。
附 錄
氯黴素標準物質衍生物的總離子流
見圖A1。
氯黴素標準物質衍生物的質譜圖
見圖A2。
氯黴素標準物質衍生物的選擇離子質譜圖
見圖A3。
