基本介紹
人工抗原製備方法,N'N-羰基二咪唑法製備RAC人工抗原,製備方法,抗原的鑑定,抗原鑑定結果,
人工抗原製備方法
根據免疫學的原理，好的抗原能夠刺激機體產生特異性高的抗體。但是作為小分子物質，其分子質量一般低於1000，很難像大分子蛋白質那樣有效激活機體的免疫系統產生抗體。因此小分子物質只具有產生免疫反應性，但缺乏免疫原性，將這種小分子物質稱之為半抗原。但是大分子蛋白質，例如常用的偶聯載體BSA、OVA、KLH、HAS等，這些蛋白質分子質量都大於30kD，當把半抗原通過適當的偶聯方法連線到這些載體蛋白上，然後用這些載體蛋白和小分子的偶聯物進行免疫時，免疫動物就會有效的產生免疫反應，從而產生針對小分子半抗原的抗體。另外，在檢測的時候，小分子物質也不能有效的被固相載體吸附，因此也必須通過偶聯載體的形式吸附與固相載體上，便於檢測。
目前，人工製備小分子完全抗原的方法很多，具體採用哪種方法進行偶聯，還需要根據小分子物質自身的分子結構，以及偶聯載體所具有的活性基團來進行製備。現在偶聯方法主要包括：混合酸酐法、戊二酸酐法、戊二醛法、碳二亞胺法、活潑酯法、羧甲基羥胺法、過碘酸氧化法、1,4-丁二醚法、對氨基苯甲酸法等。其中混合酸酐法經常被用於那些含有游離羧基的小分子半抗原與載體蛋白上游離的氨基，碳二亞胺法主要適用於含有氨基的小分子物質與所及化合物的偶聯，重氮化法主要用於小分子苯環上含有氨基的偶聯，過碘酸氧化法主要用於一些小分子物質中含有糖環化的偶聯，羧甲基羥胺法主要用於小分子含有的酮基的偶聯，活潑酯法是直接將N-羥基琥珀醯亞胺（NHS）作為活化劑，以環二己基碳醯亞胺（DCC）為脫水機不經過偶聯橋直接將小分子物質連線到載體蛋白上，這種方法也被證明產生副產物少和抗體特異性強。
小分子上與蛋白連線基團的選擇對所產生抗體的特異性的影響小分子為具有多種反應基團如氨基、羧基、醛基等的物質，這些基團既是其區別於與其相近似分子的特異性抗原決定簇之所在，也是其用於與蛋白分子的交聯的結合基團。因此，當這些基團與蛋白大分子結合後，再免疫動物所得到的抗體，往往特異性會有所降低，尤其是分子結構上相近似的小分子，如選用每種小分子物質特有基團連線蛋白，則免疫動物後所得抗體的特異性就差，因為其特異的抗原決定簇在刺激動物機體抗體的生成中不起作用，而共同的基團所組成的抗原決定簇卻不受影響，激發機體的免疫應答而產生能結合具有此決定簇的所有近似小分子的抗體。因此，選擇相關小分子均有基團用於與蛋白分子的交聯，得到的抗體具有較好的特異性。此外，在小分子與載體蛋白之間加入一連線空間臂，也能改善所得抗體的特異性。
N'N-羰基二咪唑法製備RAC人工抗原
利用N'N-羰基二咪唑將萊克多巴胺（RAC，Ractopamine））上的羥基直接與載體蛋白上的羧基偶聯製備RAC人工抗原，通過鑑定結果可以看出此方法初步可行。N'N-羰基二咪唑法製備人工抗原的過程中，由於偶聯形成的是酯鍵，不如肽鍵穩定，因此抗原的穩定性和溶劑對抗原製備效果的影響還需要進一步研究。
製備方法
①在乾燥條件下用萬分之一分析天平稱取17mg（約50μmol）RAC，溶於2.5mL分析純的四氫呋喃溶液或無水吡啶溶液，使其充分溶解。
②加入20mgCDI，於37℃條件下120r/min攪拌反應1小時，然後用氮氣吹乾四氫呋喃。
③在乾燥條件下稱取25mgBSA，溶於3mLpH7.2的PBS緩衝溶液中，使其充分溶解。
④將步驟2得到的產物用300µLDMF充分溶解後逐滴加入到配好的BSA溶液中，在室溫條件下攪拌反應4小時，轉速為120r/min。
⑤收集反應液，轉移到處理好的透析袋中，然後放入PBS緩衝液中，4℃條件下透析3天，每經過6-8個小時用預冷的新鮮PBS進行換液。
⑥透析結束後，收集透析後的產物轉入離心管中，5000r/min條件下離心10分鐘，收集上清，分裝後於-20℃條件下凍存備用。
抗原的鑑定
對N'N-羰基二咪唑法製備的RAC人工抗原分別進行濃度測定、紫外光譜掃描鑑定、SDS-PAGE凝膠電泳鑑定和免疫原性鑑定。
抗原鑑定結果
紫外光譜掃描鑑定結果
載體蛋白BSA在279nm有最大吸收峰，RAC在274nm處有最大吸收峰。採用N'N-羰基二咪唑法製備RAC-BSA人工抗原的最大吸收峰在278nm處，較載體BSA的最大吸收峰279nm有藍移現象，與相關文獻報導一致，可以說明通過N'N-羰基二咪唑法能夠將RAC與載體蛋白偶聯，從而製備RAC的人工抗原。
SDS-PAGE鑑定結果
根據BSA的分子質量，其條帶出現在65kD處，而人工抗原RAC-BSA與載體蛋白BSA相比，由於載體BSA上偶聯有RAC分子，分子質量有所增加，出現滯後現象，與混合酸酐法相比，兩種方法製備的抗原都出現了不同程度的拖尾現象，再次證明通過N'N-羰基二咪唑法可以將載體BSA與RAC分子進行偶聯。
效價測定結果
從效價結果可知，當把N'N-羰基二咪唑法製備的RAC-BSA作為免疫原免疫Balb/c小鼠，把Linker法製備的RAC-OVA作為包被原用於ELISA檢測小鼠血清效價，免疫兩隻小鼠效價平均值測得小鼠的效價達到1：6400，從效價結果可知，N'N-羰基二咪唑法製備的RAC-BSA產生抗血清效價較1,4-丁二醚法和混合酸酐法低，原因可能是CDI法製備RAC人工抗原過程中偶聯效率不高造成的。
