基因敲除（knockout）是用含有一定已知序列的DNA片段與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發生同源重組,整合至受體細胞基因組中並得到表達的一種外源DNA導入技術。它是針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被禁止，並可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。
基本介紹
- 中文名：基因敲除
- 外文名：knockout
- 定義：一種基因修飾技術
- 出現時間：20世紀90年代
- 優點：克服了隨機整合的盲目性和偶然性
- 主要套用：動物模型的建立
- 運用技術：同源重組
研究歷程,理論來源,操作步驟,獲得幹細胞,載體構建,導入基因,性狀改變,技術套用,
研究歷程
基因敲除技術是20世紀80年代發展起來的，是建立在基因同源重組技術基礎以及胚胎幹細胞技術基礎上的一種新分子生物學技術。所謂胚胎幹細胞(EmbryonicStem cell，ES)是從著床前胚胎(孕3—5天)分離出的內細胞團(Inner cellmass，ICM)細胞，它具有向各種組織細胞分化的多分化潛能，能在體外培養並保留髮育的全能性。在體外進行遺傳操作後，將它重新植回小鼠子宮，它能發育成胚胎的各種組織。而基因同源重組是指當外源DNA片段大且與宿主基因片段同源性強者並互補結合時，結合區的任何部分都有與宿主的相應片段發生交換(即重組)的可能，這種重組稱為同源重組。
基因敲除和基因嵌入技術是上個世紀90年代出現的最新外源DNA導入技術。基因敲除是基因打靶技術的一種，類似於基因的同源重組。指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中。此法可產生精確的基因突變，也可正確糾正機體的基因突變。基因嵌入又稱基因置換，它是利用內源基因序列兩側或外面的斷裂點，用同源序列的目的基因整個置換內源基因。用於基因敲除和基因嵌入的技術有Cre/Lox P系統、FLPI系統等。
理論來源
基因敲除就是通過同源重組將外源基因定點整合入靶細胞基因組上某一確定的位點，以達到定點修飾改造染色體上某一基因的目的的一種技術。它克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質的方法。這項技術的誕生可以說是分子生物學技術上繼轉基因技術後的又一革命。尤其是條件性、誘導性基因打靶系統的建立，使得對基因靶位時間和空間上的操作更加明確、效果更加精確、可靠，它的發展將為發育生物學、分子遺傳學、免疫學及醫學等學科提供了一個全新的、強有力的研究、治療手段，具有廣泛的套用前景和商業價值。基因敲除技術主要套用於動物模型的建立，而最成熟的實驗動物是小鼠，對於大型哺乳動物的基因敲除模型還處於探索階段。
操作步驟
基因敲除基本步驟示意圖獲得幹細胞
基因敲除一般套用於鼠，而最常用的鼠的種系是129及其雜合體，因為這類小鼠具有自發突變形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的傾向，是基因敲除的理想實驗動物。而其他遺傳背景的胚胎幹細胞系逐漸被發展套用，最來自於C57BL/6×CBN/JNCrjF1小鼠的胚胎幹細胞系成功地用於基因敲除。由於這些遠交系遺傳背景複雜，所得到的模式小鼠往往不能得到重複性好的實驗結果，所以也需要在C57BL/6等近交系小鼠上做回交。 另一方面，因為回交次數不一樣，也會造成實驗結果重複性差。這對生物科研，尤其是醫藥企業，安評中心，藥檢部門等，是一個很大的缺點。這對開發製作標準模式動物也是一個很大的缺陷。所以，如果能夠直接用C57BL/6 ES細胞進行基因打靶，就將直接獲得C57BL/6品系的模式小鼠。c57BL/6小鼠種系等已經廣泛的套用於免疫學，神經學，癌症，等幾乎所有研究領域。已經有一些公司或科研機構已經開始用C57BL/6遺傳背景的胚胎幹細胞進行基因打靶。
載體構建
把目的基因和與細胞內靶基因特異片段同源的DNA分子都重組到帶有標記基因(如neo基因，TK基因等)的載體上，此重組載體即為打靶載體。因基因打靶的目的不同，此載體有不同的設計方法，可分為替換性載體和插入型載體。如為了把某一外源基因引入染色體DNA的某一位點上，這種情況下應設計的插入型載體要包括外源基因(即目的基因)、同源基因片段及標記基因等部分。如為了使某一基因失去其生理功能，這時所要設計的替換型打靶載體，應包括含有此靶基因的啟動子及第一外顯子的DNA片段及標記基因等諸成分。根據實驗目的不同，打靶載體分為全基因敲除，條件性基因敲除，基因敲進，誘導性基因敲除等打靶載體。
導入基因
將基因打靶載體通過一定的方式(常用電穿孔法)導入同源的胚胎幹細胞(EScell)中，使外源DNA與胚胎幹細胞基因組中相應部分發生同源重組，將打靶載體中的DNA序列整合到內源基因組中從而得以表達。一般地，顯微注射命中率較高，但技術難度較大，電穿孔命中率比顯微注射低，但便於使用。
用選擇性培養基篩選已擊中的細胞
一般地，篩選使用正、負選擇法，比如用G418篩選所有能表達neo基因的細胞，然後用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表達的細胞，剩下的細胞為命中的細胞。由於用於TK篩選的Gancyclovir對小鼠的種系傳遞有影響，一般採用DTA(白喉毒素A亞基）進行陰性篩選。將篩選出來的靶細胞導入鼠的囊胚中，再將此囊胚植入假孕母鼠體內，使其發育成嵌合體小鼠。
性狀改變
通過觀察嵌和體小鼠的生物學形狀的變化進而了解目的基因變化前後對小鼠的生物學性狀的改變，達到研究目的基因的目的。
技術套用
基因敲除技術主要套用於動物模型的建立，而最成熟的實驗動物是小鼠，對於大型哺乳動物的基因敲除模型還處於探索階段。
近年來，牛、羊、豬、猴等大型哺乳動物實現了基因敲除。但由於狗的生殖生理較為特殊，基因敲除狗的培育難度大為增加，狗基因組的定點修飾一直未獲成功。針對這一問題，研究團隊設計了一個自體移植的策略，克服了供體胚胎與受體雌犬的生殖周期不同步的難題，大幅提高妊娠率，基因打靶狗得以誕生。
2015年10月，中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院聯合南京大學南京生物醫藥研究院、廣州醫藥研究總院等科研單位共同培育的兩隻基因敲除狗比格犬“大力神”和“天狗”遠比同齡小狗顯得強壯矯健，它們是世界上首例基因敲除狗。被敲除了肌肉生長抑制素基因後，它們的肌肉生長發育能力增強，4個月時就比普通狗更為肌肉發達，成年後具有更強的運動能力。狗在營養代謝、生理解剖等方面與人類極其相似，是研究人體生理和疾病發生機理的理想實驗動物。基因敲除狗的培育將為人類疾病治療和藥物研發提供新的實驗動物模型，也將加速培育更多含優良遺傳性狀的新品系狗。
