正負選擇系統

正負選擇系統是基因打靶的常用篩選方法之一。為了更好地篩選發生同源重組的克隆，1988年Mansour等人設計了正負雙向選擇系統(positive-negative-selection, PNS), 解決了定點整合與隨機整合的鑑別問題。

基本介紹

• 中文名：正負選擇系統
• 定義：基因打靶的常用篩選方法之一
• 設計者：Mansour
• 設計時間：1988年

理論基礎

同源重組時，只有載體的同源區以內部分發生重組，同源區以外部分將被切除。隨機整合時，是在載體的兩端將整個載體連入染色體內。置換型載體含有正負選擇基因各一，正選擇基因多為neo基因，位於同源區內，其在隨機整合和同源重組中均可正常表達。負選擇基因在靶基因同源區之外，位於載體的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重組時，tk基因將被切除而丟失，相反在隨機整合時，所有的序列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使無毒的丙氧鳥苷（GANC，也稱為鳥嘌呤）轉變為毒性核苷酸，而殺死細胞，因而可用丙氧鳥苷篩選排除隨機整合的細胞株。故同源重組時，G418和 GANC都有抗性，隨機整合時對G418有抗性，但對GANC敏感，細胞將被殺死，無整合的將被G418殺死。用G418作正篩選，選出含有neo基因的細胞株，再用丙氧鳥苷作負篩選淘汰含有tk基因的細胞株，保留未含有tk基因的同源重組細胞株。此方法是目前套用較廣泛的一種策略。正向篩選標記基因 Neo具有雙重作用，一方面導致靶基因的插入突變；同時作為重組細胞的正向篩選標誌，該基因產物可使細胞在含有新黴素的培養基中生長。除了上述方法外，還可用PCR及Southern雜交法進一步篩選及鑑定中靶細胞。

常用的選擇標記基因

正選擇標記基因有新黴素磷酸轉移酶（neo）、潮黴素B磷酸轉移酶（hph）、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉移酶（gpt）、次黃嘌呤磷酸轉移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤黴素乙醯轉移酶（puro）。

負選擇標記基因有單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）、SacB、 rpsl（strA）、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、 ccdB等[14]。

正相選擇法（positive selection method）

麻省理工學院Sharp教授的研究組獨辟新徑，建立了一種新的同源重組選擇方法—正相選擇法[15]。這種選擇法適用於在靶細胞內正常表達的基因的定點突變。其主要程式是：將選擇標記基因 neor的啟動子和起始密碼剪下掉，再嵌合入打靶載體中與靶位點同源的序列內，將打靶載體轉染進靶細胞，可能出現下面幾種情況：①打靶載體不整合入靶細胞基因組，將隨傳代而丟失；②外源打靶序列隨機整合，由於neor基因缺失了其自身的啟動子和起始密碼，整合位點周圍亦無啟動子，使neor基因的表達受阻；③雖是隨機整合，但其整合位點側翼序列在其它基因的啟動子能啟動neor基因的表達；④外源打靶載體與靶位點發生了同源重組，則neor基因可藉助靶基因自然存在的其和起始密碼的作用而呈現表達活性。因此，如用G418篩選，則抗性細胞中將只包含後兩種可能情況，根據這兩種情況下基因組DNA酶切圖譜的不一致，用Southern印跡雜交即可檢測出同源重組的克隆。

利用正相選擇法，Sharp等對NIH/3T3細胞轉化而來的MT-1.4細胞系中的癌基因pmt成功地進行了定點突變。之後不久，哥倫比亞大學的 Schwartzberg等用此方法也實現了另一種細胞癌基因c-abl在 ES細胞中的定點突變。最近，利用與正向選擇法相似的原理，Jasin等對小鼠T淋巴細胞系CD4位點亦成功地進行了定點突變。