核酸電泳

帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。核酸電泳是進行核酸研究的重要手段,是核酸探針、核酸擴增和序列分析等技術所不可或缺的組成部分。核酸電泳通常在瓊脂糖凝膠或聚丙烯醯胺凝膠中進行,濃度不同的瓊脂糖聚丙烯醯胺可形成分子篩網孔大小不同的凝膠,可用於分離不同分子量的核酸片段。

基本介紹

  • 中文名:核酸電泳
  • 外文名:Nucleic Acid Electrophoresis
  • 學科:分子生物學
概念簡介,分類,套用範圍,

概念簡介

凝膠電泳操作簡便、快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度離心)所無法分離的核酸片段,是分離、鑑定和純化核酸的一種常用方法。
核酸電泳

分類

瓊脂糖凝膠電泳
1.原理 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩衝液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠,然後倒入膠模中,凝固後將形成一種固體基質,其密度取決於瓊脂糖的濃度。
將凝膠置電場中,在中性pH值下帶電荷的核酸通過凝膠網孔向陽極遷移,遷移速率受到核酸的分子大小、構象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩衝液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當時間後,大小、構象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上,從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離範圍較廣,用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA。
2.瓊脂糖凝膠電泳的儀器及試劑 儀器設備應包括水平凝膠電泳槽及其配套電泳梳、穩壓電泳儀、微波爐或普通電爐。同時配備紫外線檢測儀和照相系統。
試劑包括瓊脂糖、電泳緩衝液、溴化乙錠溶液、凝膠加樣緩衝液。
電泳緩衝液常用TBE(1 000ml中含5.4g Tris,2.75g硼酸,2ml 0.5 mol/L EDTA,pH8.0)。
溴化乙錠(ethidium bromide,EB)是一種螢光染料,它可以嵌入核酸雙鏈的配對鹼基之間,在電泳過程中隨核酸片段遷移,將凝膠置紫外光下,插入核酸鏈中的EB在紫外線激發下產生紅色螢光,可清楚顯示各核酸片段的遷移。EB見光易分解,應存棕色試劑瓶中於4℃下保存。由於 EB是一種強的誘變劑並有中度毒性,使用時必須戴手套操作。
常用的凝膠加樣緩衝液有4種,見下表:
凝膠加樣緩衝液
緩衝液類型
6×緩衝液配方
貯存溫度
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青
40%(W/V)蔗糖水溶液
4℃
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青
15%(W/V)聚蔗糖水溶液
室溫
0.25%溴酚藍
0.25%二甲苯青
30%(W/V)甘油水溶液
4℃
40%(W/V)蔗糖水溶液
4℃
3.凝膠的製備和電泳
操作方法如下:
(1) 用透明膠將玻璃板或電泳裝置所配備的塑膠盤的邊緣圈封,製成膠模,置水平工作檯上;
(2) 稱取適量瓊脂糖,置電泳緩衝液中,加熱使瓊脂糖溶解;
(3) 待溶液冷至60℃,加入10mg/ml EB貯存液,使終濃度達0.5mg/ml;
(4) 在距離膠模底板0.5-1mm處放置電泳梳,將瓊脂糖溶液倒入膠模中,厚度約3-5mm,注意避免產生氣泡;
(5) 凝膠完全凝固後,移去梳子和透明膠,將凝膠放入電泳槽。加入TBE緩衝液使恰好沒過膠面約1mm;
(6) 將DNA樣品與1/6體積加樣緩衝液混合後,加入樣品槽中;
(7) 接通電源,使樣品槽在負極端,用1-5v/cm的電壓,電泳適當時間;
(8) 電泳結束後,可將含EB的凝膠直接放在紫外線檢測儀上觀察,並拍照記錄,也可將不含EB的凝膠在0.5μg/ml的EB溶液中染色30-45分鐘,再如上觀察和拍照,記錄結果。
4.凝膠攝影
需配置135照相機,全色135膠捲,照相機固定架,近攝鏡和紅色濾光鏡以及有機玻璃防護面罩。
操作需在暗室進行,將相機固定好,把凝膠放在紫外檢測儀上適當位置,調焦,裝上紅色濾光片,按常規拍照。
亦可使用凝膠自動處理系統,但儀器費用較高。
5.EB溶液的淨化處理
由於EB具有一定的毒性,實驗結束後,應對含EB的溶液進行淨化處理再行棄置,以避免污染環境和危害人體健康。
(1) 對於EB含量大於0.5μg/ml的溶液,可如下處理:
①將EB溶液用水稀釋至濃度低於0.5μg/ml;
②加入一倍體積的0.5mol/L KMnO4 ,混勻,再加入等量的25mol/L HCl,混勻,置室溫數小時;
③加入一倍體積的2.5mol/L NaOH,混勻並廢棄。
(2) EB含量小於0.5μg/ml的溶液可如下處理:
① 按1mg/ml的量加入活性炭,不時輕搖混勻,室溫放置1小時;
② 用濾紙過濾並將活性碳與濾紙密封后丟棄。
聚丙烯醯胺凝膠電泳
1.原理 聚丙烯醯胺凝膠通過丙烯醯胺單體、鏈聚合催化劑N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨以及交聯劑N,N’-亞甲雙丙烯醯胺之間的化學反應而形成。丙烯醯胺單體在催化劑作用下產生聚合反應形成長鏈,長鏈經交聯劑作用交叉連線形成凝膠,其孔徑由鏈長和交聯度決定。鏈長取決於丙烯醯胺的濃度,調節丙烯醯胺和交聯劑的濃度比例,可改變聚合物的交聯度。
聚丙烯醯胺凝膠電泳可根據電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別達到分離目的,兼具分子篩和靜電效應,分辨力高於瓊脂糖凝膠電泳。可分離只相差1個核苷酸的DNA片段。
聚丙烯醯胺凝膠電泳用於分析和製備長度小於1kb的DNA片段。根據所要分離的核酸片段大小,可製備不同濃度的凝膠。
2.凝膠的製備和電泳 由於氧能抑制丙烯醯胺的聚合反應,灌制聚丙烯醯胺凝膠常在兩塊封閉的玻璃平板所形成的夾層間進行。在這種裝置形式下,僅有頂層的凝膠與空氣中的氧氣相接觸,從而大大減少了氧對聚合的抑制作用。聚丙烯醯胺凝膠電泳一般採用垂直裝置。
凝膠的製備和電泳操作如下:
(1) 配製試劑
① 30%丙烯醯胺:100ml雙蒸水中含29g丙烯醯胺和1g N,N’-亞甲雙丙烯醯胺。
② 5×TBE 每升溶液含54g Tris.HCl,27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)。
③ 10%過硫酸銨:10ml雙蒸水中含1g過硫酸銨。
(2) 裝置膠模 將玻璃板和墊條事先用去污劑刷洗,並經自來水和無離子水沖洗乾淨,晾乾。裝置時,將較大的玻璃板平放在工作檯上,將兩個墊條放在玻璃板兩側,塗上少量凡士林,並將上層玻璃板置於墊條上,用夾子將玻板連同墊條夾緊,底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠,除放梳子一邊外,其餘三邊套用防水膠帶密封。
(3) 根據玻璃板大小及夾層厚薄計算所需凝膠溶液量,按下表配製溶液(100ml)。
聚丙烯醯胺凝膠溶液的配製
濃度
3.5
5.0
8.0
12.0
20.0
30%丙烯醯胺(ml)
11.6
16.6
26.6
40.0
66.6
水(ml)
67.7
62.7
52.7
39.3
12.7
5×TBE(ml)
20.0
20.0
20.0
20.0
20.0
10%過硫酸胺(ml)
0.7
0.7
0.7
0.7
0.7
將35μl TEMED加入100ml混合液中,混勻,然後均勻連續注入兩玻璃板空隙中。
(4) 立即插入電泳梳,勿使梳齒下形成氣泡。
(5) 室溫聚合1小時,梳齒下出現折光帶時,表明聚合反應已經完成。若凝膠不立即使用,可用紗布或濾紙(用1×TBE浸泡)包蓋於凝膠頂部,置4℃保存1-2天。
(6) 拔去梳子,立即用水沖洗加樣孔。
(7) 除去底部膠帶,將凝膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液,驅盡凝膠底部附著的氣泡。並用1×TBE溶液沖洗加樣孔;
(8) 將核酸樣品與適量6×凝膠加樣緩衝液(見表2-28)混合,並加入凝膠加樣孔中;
(9) 接通電源,正極與下槽連線。電壓一般控制在1.8v/cm。電壓過高時凝膠產生的熱量可造成DNA區帶彎曲,甚至引起小DNA片段的解鏈;
(10) 電泳畢,取下玻板和凝膠,放在工作檯上,從夾層一角輕撬,將上面的玻板輕輕移開,並小心揭下凝膠,置染色液中染色並進行結果觀察。
3.凝膠的染色和觀察 聚丙烯醯胺凝膠中核酸帶的染色,常用溴化乙錠法和銀染法。前者與瓊脂糖凝膠的染色方法相同。
銀染法的靈敏度較高,可如下操作:
(1) 將凝膠置固定液(10%乙醇,0.5%冰醋酸)中固定10分鐘;
(2) 雙蒸水洗1-2次;
(3) 置0.01mol/L AgNO3溶液中,室溫反應15-30分鐘;
(4) 充分水洗;
(5) 置NaOH-甲醛混合液(200ml 3%NaOH,含1ml甲醛)中反應至條帶顯色清晰,本底適宜;
(6) 用5%冰醋酸終止反應。

套用範圍

瓊脂糖凝膠電泳適合分離、純化200bp-50kB長度的核酸片段,廣泛套用於基因組提取與分析、載體構建、質粒提取等方面,解析度較低,相差100bp以內的核酸片段較難分離。
聚丙烯醯胺凝膠電泳適合分離1kB以下的小核酸片段,適用於序列分析與比對、核酶分析與鑑定、小片段核酸的提取與分析等方面解析度較高,可以精確分離相差十幾至幾十bp的小片段核酸分子。

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