數字共聚焦顯微技術

數字共焦顯微技術(DCM,Digital Confocal Microscopy )使用傳統螢光顯微鏡，使光束聚焦於樣本的不同截面，獲取一系列二維圖象,然後套用各種算法，將系列圖象中焦平面上的光信息和焦平面外的光信息分離開來,進行圖象復原工作，在某種程度上可取得優於雷射共焦顯微鏡的圖象質量。並且由於DCM工作方式靈活，操作方便，適用範圍廣，價格便宜，因而己經成為迅速興起的研究熱點,，有廣泛的發展套用前景。

基本介紹

• 中文名：數字共焦顯微技術
• 外文名：DCM,Digital Confocal Microscopy
• 專業：光學、電子學顯微技術

背景

在用傳統的螢光顯微鏡進行成像時存在著一個無法克服的問題，即聚焦圖像與離焦模糊圖像混合在同一圖像中, ，致使人們很難看清所感興趣平面的圖像。為了解決這個問題，人們一直在不斷地努力研究以便找到解決方法。 1987 年，世界上第一台雷射掃描共聚焦顯微鏡研製成功，它立即成為醫學、 細胞生物學領域最先進和強有力的分析儀器 。隨後，雷射共焦顯微鏡被廣泛套用於醫學、生物學、材料科學 、半導體科學和地質學等領域。雷射共焦顯微鏡的基本原理是在螢光顯微鏡的成像基礎上 ,，採用匯聚的雷射束在樣品中激發螢光 ，且利用雷射掃描裝置進行掃描成像。其優點是聚焦平面上的標誌被雷射照明且發射螢光，而離焦平面受到針孔的限制不發射螢光，這樣得到的圖像只是樣本的光學橫斷面即聚焦平面的圖像，因此克服了傳統螢光顯微鏡圖像模糊的缺點。但雷射共焦顯微鏡同時存在以下缺點:：由於雷射具有非常高的強度，當用雷射激發樣本時會產生很高的光漂白率，因此降低了螢光分子的螢光發射能力 。另外，雷射共焦系統結構複雜，採用了非常昂貴的硬體系統，因此其價格也非常昂貴 。

近年來 ,隨著數字圖像處理技術及其算法的不斷發展，一種更好的方法———數字共焦顯微技術已經問世並且發展非常迅速 。其特點是在傳統螢光顯微鏡的基礎上利用數學算法來去除圖像中的離焦模糊，可取得好於雷射共焦顯微鏡的圖像質量, ，它可以定性、定量、定時、定位地對樣品進行分析和測量 。由於不採用雷射照明，它克服了雷射共聚焦光漂白的缺點 。

該技術以生物光學顯微鏡為基礎，以圖像復原算法為核心，採用光學切片技術通過 CCD感測器對生物細胞或組織進行序列切片圖像採集，用計算機進行去卷積圖像復原處理，獲取高清晰的細胞序列顯微圖像，還可通過三維重構, ，實現高解析度的細胞層析和三維顯示。以該技術發展的數字共焦顯微儀在生物植物學、遺傳學、醫學等領域具有廣泛的套用前景。

數字共聚焦顯微系統原理

數字共焦顯微系統的原理是在標準螢光顯微鏡的基礎上，利用數學算法即圖像解卷積算法計算出離焦面上的螢光圖像成分，並且從原圖像中去掉它，只留下人們感興趣的平面即聚焦平面的圖像。這裡所謂“共焦”是指系統採集到的圖像只來自於樣本的一個剖面。

因此 ，數字共焦顯微鏡就是在一台標準的螢光顯微鏡上配有 CCD 相機、高性能的計算機和綜合處理軟體(該軟體能通過解卷積計算方法去除圖像中的離焦信息)，從而實現對樣品的共焦觀察與測量 。

數字共聚焦顯微系統結構

如圖 1 所示，一台完整的數字共焦顯微系統一般由以下部分組成 ：

硬體部分

螢光顯微鏡

螢光是指分子在光能量的照射下，電子從基態被激發到更高的能態，當這些電子從高能態返回基態時，它們能發射出較照射光波長更長的光，即螢光。螢光顯微鏡利用物質的螢光特性，採用螢光物質如螢光素和若丹明對樣品進行螢光染色 , ，對染色後的樣本進行螢光成像和觀測。目前，高性能的螢光顯微鏡主要有 Leica 、Zeiss、Nikon 和 Olympos，這些顯微鏡均可實現全自動和計算機控制 。幾乎所有的部件，包括物鏡的選擇，濾波器的選擇以及Z 軸工作檯的位置，均可實現計算機自動控制 。

圖1 數字共聚焦顯微系統結構框圖

CCD 相機

CCD 相機是一種在晶體矽片上形成的光子陣列探測器件，與傳統的膠片攝影相比，它具有實時 、數位化、線性和量化的特點。因此在採集螢光圖像數據時，採用 CCD 相機是一種最好的方法。在選擇 CCD 相機時一般採用科學級製冷 CCD 相機，這種相機線性好、解析度高(畫幅尺寸一般在 1024 ×1024 像素以上)且具有非常高的動態範圍(14bits 或更高)。通過製冷可消除 CCD 的熱噪聲。

計算機

計算機一方面用來控制顯微鏡和 CCD 相機,，另一方面對採集到圖像進行解卷積、三維重建等功能的處理和分析。由於解卷積算法計算量很大，因此要求計算機要有高的運算速度和大的 RAM (一般在 0 .5 ～1GB 數量級)。

軟體部分

核心基本程式

這是一個系統操作平台 ，可實現圖像資料庫和顯示測量的管理。它能對圖像進行標註、顯示、編輯和重正化, ，也可對二維和三維圖像進行偽彩色處理 。它支持各種輸入和輸出圖像數據格式。支持附加到該程式中的各種擴展模式。

數據採集模式

該模式通過對 CCD 相機的控制來進行圖像數據採集。它能控制曝光時間 , 實現二維 、多標記 、三維和四維圖像數據採集。

硬體控制模式

該模式能對顯微鏡 、X-Y 平台 、Z 軸位置、濾波輪、快門、RGB 濾波器、快速波段開關和單色儀等進行控制 ,從而實現光學切片 、三維圖像數據採集和多標記成像等功能。

解卷積模式

解卷積就是利用點擴散函式(PSF)的成像概念,採用數學計算方法去除圖像中的離焦模糊成分。目前解卷積算法主要有以下三種:①最近鄰域法：該方法是一種根據離焦平面上的圖像數據來去模糊的算法。它假設聚焦平面與樣本相交 , 使用直接記錄的離焦平面上的圖像數據來去模糊。②非鄰域法：非鄰域法類似於最近鄰域法, 不同的是它採用聚焦平面上的圖像數據來計算離焦平面上的圖像。該方式只適用二維圖像去模糊 。③約束疊代法：該方法是解卷積算法中最嚴密和精確的算法, 但計算量很大 。它採用全部採集到的圖像數據來去模糊,因此可建立一個量化的三維樣本模型 。它假設樣本全部包含在所採集到的圖像數據中, 採用了疊代能量最小算法。

三維顯示和測量模式

為了能夠充分顯示採集到的樣本圖像的三維特徵,該模式提供以下的顯示方式:①主顯示方式：可實現軸上和軸外圖像的顯示;②三維坐標顯示方式：分別顯示 X 、Y 、Z 軸的圖像切片;③分割顯示方式：顯示一幅圖像中的一系列切片,實現不同切片的並列比較 ;④通道顯示方式：顯示每個通道中的一幅圖像切片,實現不同通道中給定切片的並列比較;⑤投影顯示方式：依照透視原理和垂直投影法,產生一個生動的三維顯示 。另外 ,該模式支持偽彩色 ,單色和反轉色等形式的顯示 。

三維分析模式

該模式通過掩膜提供廣泛的三維分析能力。掩膜可描繪顯示感興趣的區域 ,為此能生成許多統計量 ,如體積、集成強度和傅立葉描述子。一幅圖像有許多相關的掩膜, 通過 AND 、OR 和 NOT 運算操作能把這些掩膜組合在一起 。使用掩膜還可生成不同通道內人們感興趣區域的統計量 ,如空間定位和相關。

比率成像模式

該模式可使用 FURA 和 INDO 等螢光探針 ,實現樣本的比率成像 。根據不同的 CCD 相機,該模式能實現每秒 3 ～ 5 個比率的速度 。它還可以實現在低速情況下的三維數字共焦鈣成像。

四維成像模式

該模式可實現隨時間變化的三維成像。

數字共焦顯微系統的特點

與雷射共焦顯微鏡相比 ,數字共焦顯微系統具有以下特點 ：

不產生光漂白

雷射共焦顯微鏡在工作時採用會聚的雷射進行掃描成像,由於雷射具有非常高的強度,當用雷射激發樣本時會產生很高的光漂白率 ,因此降低了螢光分子的螢光發射能力。而數字共焦顯微鏡工作時採用氙燈或汞燈來照明激發樣本 ,所以不會受到光漂白的影響 。

寬的照明激發光譜

數字共焦顯微系統採用氙燈或汞燈作為光源, 其光譜範圍從紫外到近紅外 。而雷射共焦顯微鏡使用的光源為雷射,具有非常好的單色性 ,這樣就在很大程度上限制了該系統的使用。

易於操作使用

數字共焦顯微鏡在觀察和採集圖像時利用的是同一光學系統,在觀察圖像的同時很容易抓取所需要的圖像。而對於雷射共焦顯微鏡, 由於觀察和採集採用不同的光學系統 ,因此使用時給實驗者帶來不便。

工作方式靈活

數字共焦顯微系統工作方式非常靈活 , 可以在亮場、暗場、位相對比和 DIT 方式下工作 ,而雷射共焦顯微鏡則不能。

價格便宜

雷射共焦顯微鏡結構非常複雜, 採用了雷射掃描成像系統和雷射器等其它硬體 ,所以其價格非常昂貴,一般在 20 萬美元以上 。而數字共焦顯微系統結構比較簡單 ,其核心部分在於軟體, 因此其價格比較便宜,一套完整的數字共焦系統的價格差不多只是雷射共焦系統的一半。

展望

綜上所述, 數字共焦顯微技術是顯微技術領域一個新的奇蹟和發展方向。自從問世以來 , 它就受到了人們的廣泛關注和套用 。另外,人們對圖像復原技術和算法的研究在不斷發展和進步，最近在三維超解析度復原算法方面,又取得了新的進展。這無疑會更加促進數字共焦顯微技術的發展 ，獲得更加高質量的樣本圖像 。隨著人們對數字共焦顯微技術的深入認識， 隨著新算法 、新的分析方法和軟體的不斷開發, 相信數字共焦顯微技術會有更大的發展和更加廣闊的套用前景。