微生物分離技術

現有的環境微生物種類繁多，總數龐大，針對不同的微生物對能量、營養和理化條件的需求不同（包括各因子的種類和濃度不同），對現有培養基經過適當的最佳化改造可以用於新的微生物的分離培養。微生物分離培養技術在微生物環境功能研究、代謝途徑的闡明、特定功能的驗證及基礎實驗和生產實踐的套用等方面發揮著重要作用。

基本介紹

• 中文名：微生物分離技術
• 外文名：Microorganism separation technology
• 微生物：細菌，真菌，病毒等
• 純培養：單一種類存在狀態下進行生物培養
• 微生物分離：將混雜著各種微生物的樣品分離開
• 培養基：供微生物生長的人工配製養料

定義

根據微生物的特性和生長特點，模擬微生物的生態環境以不同的培養基和培養條件對微生物進行分離、純化的過程。目前自然界中只有極少部分微生物能夠得到分離與培養，嚴重阻礙了對微生物生命活動規律的研究和微生物資源的開發。改進傳統的分離與培養方法，採用新型分離與培養技術，提高微生物可培養性，大量培養自然界中存在的微生物，從而更全面、準確地了解微生物細胞的生命規律、獲悉微生物群落中各種微生物之間的動態相互作用和相互協調的規律，對環境微生物工藝進行準確地設計、精細地調控和高效地利用。

培養方法技術

微生物平板培養方法：微生物平板培養方法是一種傳統的實驗方法。這種方法主要使用不同營養成分的固體培養基對土壤中可培養的微生物進行分離培養，然後根據微生物的菌落形態及其菌落數來計測微生物的數量及其類型。平板稀釋法是進行土壤微生物分離培養的常用方法，一般分為稀釋→接種→培養→計數等幾個步驟。然而，這種方法也存在不少缺陷，主要表現在固體培養基的選擇和實驗室培養條件等方面的限制上。

套用

原因

對微生物進行常規培養時，由於生活條件的改變，有些微生物不能適應而死亡，另一些則通過產生孢子進入休眠狀態或改變細胞形態、進入維持一定代謝活性但不生長繁殖的“活的非可培養態”，結果均表現為微生物的“不可培養性”。

（1）採用高濃度的營養基質：最初對微生物的培養是在富含營養的培養基中進行的，但是由於自然界中微生物數量龐大，其可利用的營養物質極度匱乏，多數處於“岔營養”狀態。常規純培養對這種認識不充分，通常將寡營養微生物迅速置於富營養狀態，微生物初期的快速生長會產生大量的、微生物自身難以調節的過氧化物、超氧化物和羥基自由基等“毒性氧物質”，該類物質快速、過量的積累會破壞細胞內膜結構導致細胞死亡，從而表現出微生物的不可培養性。

（2）實驗室中無法完全模擬自然界的環境條件：由於目前監測技術和手段的限制，人們對微生物生存環境和自然條件了解尚不充分。因此，人們沒有或無法完全模擬微生物的自然生存條件，而通常將培養條件進行簡化，將微生物置於恆溫、恆濕、黑暗等環境中；將微生物限制在“板結”的瓊脂或不擾動的液體介質中；簡化微生物的營養組成沒有提供微生物生長繁殖所必需的某些化學物質，等等。所以在自然界中可以生長繁殖的微生物，在“純培養”中生長條件得不到滿足，從而導致了微生物的不可培養性。

（3）環境微生物之間的相互關係被忽略：微生物相互關係繁多複雜，包括：種間的偏利共生關係和互惠共生關係，兩者的共性是至少一個群體提供另一些群體所需的生長因子而使微生物群體獲利；群體感應，這種關係被認為是通過細菌間的信息交流來調控細菌的群體行為：細胞通過感應一種胞外低分子量的信號分子來判斷菌群密度和周圍環境的變化，從而調節相應的細菌表達以調節細菌的群體行為。以上這兩種關係都是微生物生長所必需的。

（4）生長緩慢的微生物被忽視：環境中很多微生物都聚集生長，當將這些微生物接種至培養基時，適合生長的微生物由於生長快而占據優勢地位，它們對營養成分的大量攝取使生長緩慢的微生物得不到充足營養而生長受到抑制。

措施

（1）減少毒性氧物質的毒害作用：由於常規培養方法使用的高濃度營養基質不利於微生物生長，適當降低營養基質的濃度可以減弱這種不利影響。發現低濃度基質的培養基培養出的細菌在數量和種類上均多於高濃度基質的培養基，但營養濃度過低時會使培養出的微生物數量反而下降。

（2）維持微生物間的相互作用：在培養基中加入微生物相互作用的信號分子就可簡單模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長繁殖的要求。

（3）供應新型的電子供體和受體：不同微生物的代謝過程不同，因此對反應的底物要求也不盡相同。供應微生物需要的特有底物有助於新陳代謝反應的進行及微生物的正常生長。大量的研究表明，將新穎的電子供體和受體套用到微生物培養中，能夠發現未知的生理型微生物。

（4）分散微生物細胞：自然界中很多微生物聚集生長，形成“絮體”和“顆粒”等，致使其內部的微生物不易被培養。對“絮體”和“顆粒”進行適度的超聲處理，將細胞分散再進行培養，可以使更多的微生物接觸培養基而得到培養。

（5）延長培養時間：對“寡營養菌”的培養，可適當延長培養時間，使其能長至肉眼可見的尺度。當然培養時間不能無限增長，因為培養時間越長，對培養環境的無菌要求就越高。

（6）利用瓊脂替代物：瓊脂對某些微生物具有毒性作用，採用無害且凝結作用較好的替代物質作為培養基固化劑，可以增加微生物的可培養性。

開發新型分離

稀釋培養法和高通量培養法

在地球環境中，海洋環境中迄今可培養微生物的比例最低，僅為0.001%-0.1%，這是由於海洋環境中主要是寡營養微生物，它們在人工培養時往往受到少數優勢生長的微生物的競爭作用而不能生長。

擴散盒培養法

Kaeberlei等在分離培養潮間帶底泥中的微生物時使用一種新穎的自製培養儀器，為其起名為擴散盒。擴散盒由一個環狀的不鏽鋼墊圈和兩側膠連的0.11μm濾膜組成，濾膜只能允許培養環境中的化學物質通過而不能讓細胞通過。

細胞包囊法

Zengler等將海水和土壤樣品中的微生物先進行類似稀釋培養法的稀釋過程，然後乳化，部分微生物形成了僅含單個細胞的膠狀微滴。然後將膠狀微滴裝入層析柱內，使培養液連續通過層析柱進行流態培養。層析柱進口端用0.11μm濾膜封住，防止細菌的進入而污染層析柱;出口端用8μm濾膜封住，允許培養產生的細胞隨培養液流出。該方法的特點是讓微生物在開放式培養液中生長，使培養環境接近於微生物的自然生長環境，能夠很好地提高微生物可培養性，但成本較高，不利於普及使用。

序列引導分離技術

序列引導分離技術是根據微生物基因組中特定基因的特異性序列，設計引物或雜交探針，以培養物中目標序列存在和變化情況為標準，來指導對微生物最優培養條件的選擇，培養出新的微生物。