差別雜交又叫差別篩選，適用於分離經特殊處理而被誘發表達的mRNA的cDNA克隆。它特別適用於分離在特定組織中表達的基因、在細胞周期特定階段表達的基因、受生長因子調節的基因、以及在特定發育階段表達的或是參與發育調節的基因，同時亦可有效地用來分離經特殊處理而被誘發表達的基因。
基本介紹
- 中文名：差別雜交
- 外文名：differential hybridization
- 別稱：差別篩選
- 本質：核酸雜交
簡介,特性,
簡介
差別雜交(differential hybridization)又叫差別篩選(differential screening)，適用於分離經特殊處理而被誘發表達的mRNA的cDNA克隆。從本質上講，差別雜交也是屬於核酸雜交的範疇。它特別適用於分離在特定組織中表達的基因、在細胞周期特定階段表達的基因、受生長因子調節的基因、以及在特定發育階段表達的或是參與發育調節的基因，同時亦可有效地用來分離經特殊處理而被誘發表達的基因。目前，差別雜交篩選法在克隆基因的分離工作中有著相當廣泛的用途。
特性
差別雜交的技術基礎十分簡單，它不需要任何有關的目的基因的核苷酸序列信息，而重要的是要擁有兩種不同的細胞群體：在一個細胞群體中目的基因正常表達，在另一個細胞群體中目的基因不表達。在這種情況下便可製備到兩種不同的mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA種的總mRNA群體，其二是不含有目的基因mRNA種的總mRNA群體。
因此，可以通過這兩種總mRNA(或是它們的cDNA拷貝)為探針的平行雜交，對由表達目的基因的細胞總mRNA構建的克隆庫進行篩選。當使用存在目的基因的mRNA探針時，所有包含著重組體的菌落都呈陽性反應，在x光底片上呈現黑色斑點，而使用不存在目的基因的mRNA探針時，除了含有目的基因的菌落外，其餘的所有菌落都呈陽性反應，在x光底片上呈現黑色斑點。比較這兩種底片井對照原平板，便可以挑選出含目的基因的菌落，供作進一步研究使用。
差別雜交篩選技術已被成功地用於分析爪蟾和粘菌(Dictyostelium)的發育問題。這兩個實際例子表明，處於不同發育狀態或階段的豐度相差5倍的特異的mRNA種是能夠被檢測出來的。生長因子調節基因(growth factor—regulatedgene)的克隆，是差別雜交成功套用的一個典型例子。我們知道，血清中含有生長因子，因此用血清處理處於靜止期的細胞時，便會迅速誘發生長因子調節基因進行表達。
所以，分別從靜止期細胞培養物和經血清澈活3小時的細胞培養物中提取的poly(A)mRNA製劑，在mRNA種類上是有差別的，至少後者比前者多出了一種生長因子調節基因的mRNA種。用從激活細胞中分離的poly(A)mRNA反轉錄合成的cDNA與^噬菌體載體重組，構成eDNA文庫，並同時複製兩份硝酸纖維素濾膜。A組濾膜同血清激活細胞製備的cDNA探針雜交，B組濾膜同靜止期細胞製備的cDNA探針雜交。將所得的放射自顯影圖片進行仔細的比較，從中鑑定出只同激活細胞探針雜交而不能同靜止期細胞探針雜交的噬菌斑位置。這些克隆便有可能是帶有受血清誘發表達的生長因子調節基因的DNA編碼序列。
套用差別雜交技術分離克隆的目的基因存在著諸多方面的局限性。首先，差別雜交的靈敏度比較低，特別是對於那些低豐度的mRNA而言，這個缺點就顯得更加突出。這是因為在差別雜交中所使用的雜交探針是mRNA反轉錄成的cDNA群體。在這些同位素標記的探針中，真正能與目的基因核苷酸序列完全互補的僅占很低的比例，以至於那些低豐度的mRNA之cDNA克隆，是很難用此法檢測出來的。其次，差別雜交需要篩選大量的雜交濾膜，鑑定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗費時間和金錢的工作。況且兩套平行轉移的濾膜之間，DNA的保有量往往是有差別的，這樣所得的雜交信號的強度也就不會一致，需要重新進行點雜交，以作進一步的陽性克隆鑑定工作。所以說重複性差是差別雜交篩選法的又一個缺點。
扣除雜交技術在理論上很具吸引力,但實際操作並不容易:首先是回收cDNA量有限,並仍存在重複性差,敏感度低的缺點,這些均限制了這一技術更廣泛的使用。
