基本介紹
- 中文名：外植體
- 外文名：explant
- 含義：活植物取下組織培養的組織或器官
- 來源：通常選擇生長健壯的無病蟲的植株
- 培養條件：無菌培養
- 培養類型：繼代培養
含義,來源,種類,選擇原則,品種的選擇,所處狀態,
含義
來源
製備原生質體的供體材料來源於植物的各類組織、器官、細胞或是由之建立的細胞無性系。其中使用最多的是各種植物的葉片、愈傷組織和懸浮培養細胞，次之是根尖、莖尖和子葉。
所用植物材料的生理狀態(如光照時間、光強、光質、溫度、濕度、營養等)對原生質體的產量和存活具有 顯著影響。即使是由生長在相同條件下的外植體如葉片、胚軸、根尖等製備的原生質體，甚至是同一類型外植體所製備的原生質體，在離體培養時對各種培養基或培養條件的反應也會有不同。因此，供試植株最好生長在可控條件下，且最好用無菌苗培養。無菌苗培養物有一層很薄的表皮，酶混合物容易通過；又由於它們本身無菌，因而避免了由於表面消毒可能導致的破壞，此種來源的原生質體在生理上和遺傳特性上比較一致，也較易用酶法進行分離。用於原生質體製備的組織培養材料可以是質地鬆散的愈傷組織，但更多的是各種植物的懸浮培養細胞，一般選用繼代培養3～5d的懸浮細胞作為材料。在這種細胞群體中，主要是單細胞或細胞團，細胞壁容易酶解。另外，包括大量幼嫩的分生組織細胞以及次生細胞壁較少的外植體，在酶法去除細胞壁後，原生質體很快被釋放出來，而且原生質體經融合後容易進行細胞分裂和再生。大量的分生組織細胞意味著對再生分化培養基有很好的適應能力，更能顯示出細胞分裂，產生體細胞胚和子葉。有證據表明，有些植物只有從具有分化潛力大的外植體，如未成熟胚、幼花序、幼葉或成熟胚來誘發愈傷組織，從中選出胚性細胞系，再用以製備原生質體才能得到再生植株。
種類
植物組織培養的材料幾乎包括了植物體的各個部位，如莖尖、莖段、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花葯等。
(1)莖尖
莖尖不僅生長速度快，繁殖率高，不容易發生變異，而且莖尖培養是獲得脫毒苗木的有效途徑。因此，莖尖是植物組織培養中最常用的外植體。
(2)節間部
大部分果樹和花卉等，新梢的節間部是組織培養的較好材料。新梢節間部位不僅消毒容易，而且脫分化和再分化能力較強，也常用作組織培養的材料。
(3)葉和葉柄
葉片和葉柄取材容易，新出的葉片雜菌較少，實驗操作方便，是植物組織培養常用的材料。尤其是近年在植物的遺傳轉化中，以葉片為試驗材料的報導較多。
(4)鱗片
水仙、百合、蔥、蒜、風信子等鱗莖類植物常以鱗片為材料。
(5)其他
種子、根、塊莖、塊根、花粉等也可以作為植物組織培養的材料。但是，不同種類的植物以及同種植物不同的器官對誘導條件的反應是不一致的。如百合科植物風信子、虎眼萬年青等比較容易形成再生小植株，而鬱金香就比較困難。百合鱗莖的鱗片外層比內層的再生能力強，下段比中、上段再生能力強。選取材料時要對所培養植物各部位的誘導及分化能力進行比較，從中篩選出合適的、最易表達全能性的部位作為外植體。
選擇原則
(1)選擇優良的種質
無論是離體培養繁殖種苗，還是進行生物技術研究，培養材料的選擇都要從主要的植物入手，選取性狀優良的種質或特殊的基因型。對材料的選擇要有明確的目的，具有一定的代表性，以提高成功的幾率，增加其實用價值。
(2)選擇健壯的植株
選取發育正常的器官或組織，再生能力強，組培易成功。組織培養用的材料，最好是從生長健壯的無病蟲的植株上選取發育正常的器官或組織。因為這些器官或組織代謝旺盛，再生能力強，培養後比較容易成功。此現象可能是由於外植體內部的植物激素水平能夠在接種後得以維持所致。
(3)選擇適宜的部位
植物組織培養幾乎在植物體的各個部位都獲得了成功，這些部位包括莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細胞、表皮、塊莖的儲藏薄壁細胞、花瓣、根、莖、子葉、鱗莖、胚珠和花葯等。但是不同種類的植物以及同一植物的不同器官對誘導條件反應是不一致的，有的部位誘導分化率高，有的部位很難脫分化，或者再分化頻率很低。
(4)選擇適當的時期
組織培養選擇材料時，要注意植物的生長季節和生長發育階段，對大多數植物而言，應在其開始生長或生長旺季採樣，此時材料內源激素含量高，容易分化，不僅成活率高，而且生長速度快，增殖率高。若在生長末期或已進入休眠期時採樣，則外植體可能對誘導反應遲鈍或無反應。花葯培養應在花粉發育到單核靠邊期取材，這時比較容易形成愈傷組織。百合在春夏季採集的鱗莖、片，在不加生長素的培養基中，可自由地生長、分化；而其他季節則不能。葉子花的腋芽培養，如果在1～2月採集，則腋芽萌發非常遲緩；而在3～8月採集，萌發的數目多，萌發速度快。對於大多數植物而言，應在其生長季節開始時採樣。在生長末期或已進入休眠期時取樣，外植體可能對誘導反應遲鈍或無反應，較難成活。
(5)考慮器官的生理狀態和發育年齡
一般認為，生理年齡小的幼嫩組織較生理年齡大的成熟衰老組織具有較高的形態發生能力。隨著組織年齡的增加，器官的再生能力逐漸減弱甚至完全失去再生能力。
(6)材料大小的選擇要適宜
建立無菌材料時，取材的大小根據不同植物材料而異。材料太大易污染，材料太小，多形成愈傷組織，甚至難於成活。一般選取培養材料的大小為0.5～1.0 cm。如果是胚胎培養或脫毒培養的材料，則應更小。
品種的選擇
植物的基因型對外植體褐變發生頻率、程度都存在根本性影響,輕者影響細胞生長和繁殖,重者導致細胞死亡。這是由於基因會從根本上導致植物體內相關物質合成量有差異。在木本植物中,單寧含量或色素含量高的植物容易發生褐變, 這是由於酚類的糖苷化合物是木質素、單寧或色素的合成前體, 酚類化合物含量高, 木質素單寧或色素形成就多, 而酚類化合物含量高將導致褐變的發生,因此,木本植物一般比草本植物更容易發生褐變。在植物組織培養中,不同物種之間褐化程度差異很大, 就是同種植物的不同品種間也存在一定差異, 在比較兩類葡萄品種的褐變時, 發現酚類物質含量與褐變發生具有正相關性。同一種植物中, 幼齡材料一般比成齡材料褐變輕。馬文卿等證實, 大花蕙蘭是易褐化的植物, 由基因型導致外植體誘導和試管苗增殖中均存在褐化現象。
所處狀態
外植體取材的不同狀態具體表現為外植體生理狀態、取材部位、取材時期、外植體的大小及受傷程度、外植體預處理等。幼齡材料比成齡材料褐變輕, 這可以用幼齡材料的酚類化合物含量少, 而成齡材料多來解釋。平吉成在研究小金海棠、八楞海棠和山定子剛生成的實生苗上切取莖尖進行組培的試驗中, 發現接種後褐變很輕。高度分化的葉片作為外植體,接種後則很容易褐變, 而在幼嫩器官或組織(如胚)中, 褐變則較輕。植物體內酚類化合物含量、PPO(多酚氧化酶)活性與外植體所處的生長季節有關, 而PPO活性和酶類含量有正相關性, 春秋季較弱, 隨著生長季節的到來, 酶活性逐漸增強, 所以早春和秋季取材較為適宜。Wang等也報導“富士”蘋果和“金華”桃5 ～ 8 月取材褐變嚴重,而在9 月到翌年2月取材褐變有所減輕, 核桃的夏季材料比其他季節材料更易褐變。外植體大小對褐化的影響,表現為小的材料更易發生褐化, 相對較大的材料褐化的程度則較輕。由於膜結構或細胞中物質區域化分布的破壞是酚類物質酶促褐變的重要因素,切口越大導致酚類物質的被氧化面也越大, 褐化程度會更嚴重。Bonga等在巨桉和卡德蘭的組織培養中得出, 外植體越小, 切面與體積的比率越大, 傷害及褐化的程度越大。除了機械傷害外, 接種時各種化學消毒劑對外植體的傷害也會引起褐變。組培中常用酒精和升汞消毒。Ziv等用0.3%升汞代替Ca(ClO)2 進行消毒,可降低鶴望蘭的褐變程度。一般來說, 延長外植體消毒時間會使消毒效果增加, 但對外植體傷害也大, 從而加劇褐變。因而消毒時間應掌握在一定範圍內, 才能保證較高的外植體存活率。
