凝膠色譜淨化

凝膠色譜技術是以多孔凝膠為固定相，利用凝膠孔的空間尺寸效應，使不同大小的分子按照由大到小的洗脫順序達到分離的高效液相色譜（HPLC）方法，從而達到淨化的目的。此外，凝膠色譜還有因為惰性微球表面對有機物吸附小所以柱污染小，以及脫鹽等優點。

基本介紹

• 中文名：凝膠色譜淨化
• 外文名：Gel Permeation Chromatography
• 分離：分離大分子和小分子物質
• 淨化：根據分子大小不同來淨化目標物質
• 檢測：檢測物質中的有害成分
• 聯用：與其他分離技術聯用

基本信息

凝膠色譜是以多孔凝膠為固定相，利用凝膠孔的空間尺寸效應，使不同大小的分子達到分離的一種高效液相色譜（HPLC）方法。其分離機理類似於分子篩效應，大體積分子只能滲入少量大孔，在固定相中所經歷的路徑較短，先流出。所有孔隙都不能進入的大體積分子，不被保留，在死體積處流出。因此，溶質按分子體積從大到小依次流出色譜柱。在凝膠色譜中，流動相只起溶解樣品的作用，以有機溶劑為流動相的凝膠滲透色譜（GPC）套用較多，而以水為流動相的凝膠過濾色譜（GFC）的套用相對較少，這主要是因為水溶性大分子不僅可以溶於水，通常也能溶於有機溶劑中。四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲醯胺等非極性有機溶劑是最常用的流動相。在凝膠色譜中，固定相表面與溶質分子間不存在化學相互作用，即固定相是惰性多孔材料。目前凝膠色譜固定相主要使用半硬質凝膠（如聚苯乙烯凝膠）和硬質凝膠（如多孔矽膠和多孔玻璃珠）。軟質凝膠（如葡聚糖）因不耐壓，通常只用於低壓凝膠色譜。凝膠色譜主要用於高分子化合物的分子量及其分布的測定、中小分子有機物的分離與定量分析、生物大分子純化（製備凝膠色譜）、凝膠色譜指紋圖譜（如原油及其重質組分的評價）和樣品淨化。凝膠滲透色譜（GPC）用於樣品淨化的主要目的是為後續分析除去干擾物質（如大分子基體物質）或對樣品進行濃縮。目前， GPC淨化所用凝膠柱尺寸比用於GPC分析的要大。GPC樣品淨化採用的操作方式主要是為了分析生物樣品中的小分子有機物而除去脂肪、蛋白質等大分子干擾物質；有時為了採用液質聯用技術（HPLC-MS）等技術分析生物大分子，也可採用GPC除去樣品中的小分子或脫鹽。GPC除去大分子物質選擇的固定相的孔徑應該比較小，大分子難以進入孔道內，快速流出凝膠柱；而目標小分子可以進入孔道，在大分子物質之後流出，從而實現分離。

發展過程

凝膠色譜作為一種分離技術最早出現在1959年，porath和flodni用交聯的縮聚葡糖製成凝膠，成功分離了水溶液中不同分子量的化合物。隨後凝膠色譜技術在生物化學研究領域中迅速推廣套用，成為生物化學研究中一種常用的分離手段。1964年moore用苯乙烯和二乙烯苯在不同條件下製成了一系列不同孔徑的凝膠，這類凝膠可以在有機溶劑體系中使用，因此擴大了凝膠色譜的使用範圍，使這種技術廣泛套用於高分子科學領域，是一種快速有效的測定分子量和分子量分布的方法。60年代末，凝膠滲透色譜技術開始用於農藥殘留分析並初步實現了自動化。隨後，這項技術受到廣泛重視並在各個研究領域都取得了較好的研究結果，成為一個非常活躍的研究領域。無論在凝膠的製備，儀器的技術性能、套用研究上都取得了很大的進展，套用範圍也涉及到生物化學、高分子化學、有機和無機化學等眾多領域。

種類及套用

凝膠是凝膠色譜的核心，是對組分進行分離的基礎。已經研製和使用過的凝膠很多，製備工藝、使用技術和條件也各有不同。根據凝膠材料的來源可以分為有機凝膠和無機凝膠；根據製備方法可以分為均勻、半均勻和非均勻三種；根據凝膠使用的強度性質分為軟膠、半硬膠和硬膠三類；根據使用的溶劑範圍可以分為親水性、親油性和兩性凝膠。親水性凝膠主要用於生物化學研究中對蛋白質、酶等進行分離和分析，親油性凝膠套用於合成的高分子材料和有機體系中化合物的分離和分析。選擇和使用不同性能不同孔徑的凝膠決定了分離淨化的效果，通常可根據樣品基質類型和待分離組分的分子大小決定所選擇的凝膠的種類。

凝膠色譜儀

凝膠色譜分析柱性能穩定並且在固定的淋洗系統中可以重複使用，使凝膠色譜技術具有實現自動化的基本條件。凝膠色譜儀主要由輸液系統（包括溶劑貯存器、脫氣裝置、輸液泵、進樣器等）、色譜柱、檢測器、信號記錄儀、控制系統等部分組成。1965年waters公司的GPC 2000型凝膠色譜儀問世，隨後陸續出現各種類型的自動化凝膠色譜儀，但這些儀器主要用於分子量和分子量分布的測量。在相同色譜條件下，農藥和雜質的洗脫體積能夠保持相對的恆定，使得凝膠色譜淨化技術（尤其是自動化凝膠色譜技術）在農藥殘留分析中的套用日趨廣泛。

聯用技術

基質比較複雜或者含有雜質較多的樣本（如含有大量的油脂，色素，生物鹼等），經過凝膠色譜淨化雖然可以除去大部分大分子雜質，但是，與農藥分子大小相近的雜質卻無法去除，對剩餘的這一部分雜質需要使用其它淨化技術進一步掙化，以防止雜質污染進樣口或柱頭，或者雜質占據分析系統中的活性點，導致色譜分離能力降低、干擾嚴重，儀器靈敏度降低，或產生基質增強效應等。

凝膠色譜法和吸附色譜法或其他淨化技術聯用，可以達到徹底淨化樣本雜質的目的。其中，固相萃取技術是常用的樣品淨化技術之一，根據分析物和雜質在固定相上吸附和解吸附的行為不同分離目標物與雜質，實現對樣品的淨化。目前，以這兩種淨化方法聯用為主，其聯用形式主要有離線聯用和線上聯用兩種。較為常用的是離線凝膠色譜一固相萃取聯用技術。樣品經凝膠色譜淨化，收集所需組分並濃縮，再根據化合物和剩餘雜質的類型和性質，採用固相萃取技術，使用不同性質的固相萃取吸附劑進一步淨化。Ueno-E等採用GPC和Florisil聯用淨化技術，分析了多種蔬菜和水果中多種農藥殘留；Furusawa N等採用該方法分析了雞蛋中有機氯農藥殘留；Ueno-E等人採用GCP與活性碳色譜及Florisil聯用，建立了農藥多殘留分析方法並實際檢測了203個農產品中的農藥留；Pantiru-M等人研究了各類固相萃取柱與GPC聯用，分析了蔬菜、水果和穀物中15種氨基甲酸酷和15種酸性農藥殘留閱。可見，目前離線GPA-SPE技術在農藥殘留分析前處理中套用和研究較多。