基本介紹
- 中文名：免疫酶擴散法
- 外文名：agar gel immunodiffusion
- 英文簡寫：AGID
- 簡稱：瓊擴試驗
- 本質：抗原抗體免疫沉澱反應
- 用於：血清學定型
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免疫酶擴散法
瓊脂凝膠免疫擴散試驗(agargelimmunodiffusion，AGID)簡稱瓊擴試驗，是在瓊脂凝膠中進行的抗原抗體免疫沉澱反應，可用於血清學定型，簡便快捷。將待檢的純化細菌接種於固體培養基上，刮取培養24h後的菌苔，懸浮於含85g/LNaCl、0.02mol/L磷酸鹽、3mL/L福馬林的溶液(pH7.0)中，100℃水浴加熱1h，然後以1500r/min離心30min，吸取上清液即為待檢抗原。通過觀察待檢抗原與標準抗血清之間是否形成明顯、清晰可見的沉澱線，可以確定血清型。
免疫酶擴散法的問題
血清分離技術問題
被檢動物血清的分離是血清學試驗的必需環節。根據凝血原理，從血液流出到血清析出的時間(健康狀況下)，馬為11.5分鐘，牛為6.5分鐘，綿羊為2.5分鐘，豬為3.5分鐘。在594份牛血液中，有289份採血後，在室溫下斜置5-6小時，血液凝固不好，血面上有一層白色膠凍樣物質而沒有血清析出，將血液分組分別在1000℃rpm/分，2000rpm/分，3000rpm/分，4000℃rpm/分離心15-20分鐘，同樣沒有結果。最後用無菌小玻棒劃破血斜面，於37℃巨溫箱放置30分鐘後，再取出放於4℃冰櫃內，15-20分鐘就析出清澈透明血清，放置時間越長，析出的血清越多，一般5毫升血液可析出1-2毫升血清。
瓊脂濃度的影響
瓊脂濃度決定瓊脂凝膠孔徑的大小，孔徑與濃度呈負相關(反比)，孔徑的大小直接影響抗原抗體分子的擴散，抗原分子量較大的，擴散時所需孔徑要大，則要求瓊脂濃度稍低，反之亦然。一般瓊脂濃度在1%,0.8%，0.6%時，其凝膠孔徑允許通過的抗原分子量分別在2×10^6,2.5×10^6,3×10^6道爾頓左右。我們進行牛黏膜病、口蹄疫、蘭色病瓊擴抗原與標準陽性血清預試時按規程要求操作，於37℃恆溫箱48小時不出現沉澱線。經實驗，是反覆溶化瓊脂時部份水份蒸發和恆溫箱中濕度不夠，使瓊脂實際濃度過大影響了抗原抗體雙擴散。
pH值、離子強度的影響
反覆溶化瓊脂對pH值也有影炯，pH值過高或過低可使形成的抗原抗體複合物重新離解。一次性配瓊脂量大，用不完，下次再溶化時不惻pH值，如此反覆，使瓊脂液酸鹼度不精確而影響沉澱線的出現。所以每次溶化瓊脂，制板前都要用NaOH和HC1重新滴定所要求的pH值。
免疫酶擴散法研究鴨疫里默菌
鴨疫里默菌病是由鴨疫里默菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起的主要侵害雛鴨、雛火雞等多種禽類的急性或慢性的接觸性傳染病。在世界各養鴨地區幾乎都有流行，特別是在東南亞國家。在我國由郭玉璞(1982)首次報導。該病多發生於2周齡～7周齡的小鴨，自然感染髮病鴨臨床表現為精神不振、食慾下降、嗜眠、歪頸、跛行、眼鼻有漿液性或黏液性分泌物，排黃綠稀糞，隨後出現痙攣、搖頭、角弓反張等神經症狀，病癒的鴨體重減輕，生長遲緩。以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、乾酪性輸卵管炎和腦膜炎為其病變特徵。其發病率在5%～90%、病死率一般在1%～80%，高峰時可達90%甚至100%，目前已成為影響養鴨業最為嚴重的細菌性傳染病，經濟損失嚴重。在診斷上，根據其流行情況、臨床症狀和病理變化，一般可做出初步診斷，但確診必須依賴於實驗室技術手段。目前，RA的診斷方法主要有細菌分離鑑定、瓊脂擴散試驗、凝集試驗、螢光抗體試驗、間接ELISA、PCR、間接免疫酶組織化學法等。
PathanasophonP等根據瓊擴試驗結果，提出了20型和21型RA，程安春等提出了4個新的血清型即22型～25型，張大丙等先後鑑定出1，2，6，7，10，11，13，14，15型及17型共10個血清型，並將不同的10型分離株區分為5個亞型。雖然這個方法特異性比較高，但該試驗結果反應了不同菌株之間的抗原差異，而非血清型的差異，最終的鑑定還需要依靠其他試驗，並進行大量的細菌對比工作。
免疫酶擴散法研究蓋他病毒
蓋他病毒（Getahvirus，GETV）是一種單鏈線形的RNA病毒屬披膜病毒科甲病毒屬成員，該病毒廣泛分布於亞洲地區及澳大利亞北部的太平洋沿岸地區。該病毒可以引起家畜疾病，如馬的發熱、皮疹、後腿水腫及淋巴結腫大，並能引起豬的流產等，因此該病毒被確定為重要的動物源性病原體。
免疫酶擴散法操作簡單，但敏感性差。可選用病豬的脾、淋巴結和迴腸小段為病料製備抗原，但以胰腺最好。用pH8．6的巴比妥緩衝液配製1．2%瓊脂，內加萬分之一柳硫汞防腐。按中央1孔、周圍6孔的模式打孔，孔徑5mm，孔間距6mm。檢測抗原時，將高免血清滴入中央孔內，周圍孔內分別加入標準抗原和待檢病料乳劑。檢測抗體時，將標準抗原滴入中央孔內，周圍孔的上、下2孔內滴加高免血清，其他4孔滴加被檢血清。此方法的最大缺點是誤診率高。
