《克隆牛重編程中核質互作分子機理的探討》是依託上海交通大學，由曾凡一擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：克隆牛重編程中核質互作分子機理的探討
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：曾凡一
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
動物克隆中的核-質相互作用對體細胞重編程起決定性作用，但具體機制不明。我們將從卵母細胞、供體細胞和核質互作多方面考察重編程的分子機理。本課題以活體取卵獲得的遺傳背景清晰且經線粒體DNA分型的牛卵母細胞為核受體進行核移植，以克隆效率有差異的同體、線粒體同型異體和異型克隆胚胎為模型，體外受精胚作為對照，研究不同核-質組合克隆胚胎的重編程情況。結合已建立的單胚胎極微量RNA（pg級）抽提技術和RNA線性擴增技術，採用牛基因組表達譜晶片研究同體、同型和異型克隆胚胎表達模式，通過生物信息學手段篩選差異表達基因，重點分析在重編程和核質互作中起重要作用的基因，設計特異的siRNA，在胚胎水平驗證差異基因功能，揭示重編程的分子機制，構建克隆動物著床前胚胎髮育過程中核質互作和表觀遺傳調控網路圖，闡述兩者之間的關係。
結題摘要
為了闡明克隆重編程中重編程的關鍵分子機制，本課題以活體取卵(OPU)獲得的遺傳背景清晰的牛卵母細胞，利用PCR-RFLP技術對線粒體DNA進行分型，並與不同線粒體分型的體細胞組合進行核移植，在此基礎上開展以下研究：比較不同線粒體單倍型卵母細胞與供核細胞不同組合在著床前和著床後的克隆效率；對發育過程中的關鍵因子如Oct4、Nanog和Sox2等在同型和異型克隆胚胎中的DNA甲基化狀態進行分析。為了闡明核移植的分子機制，本課題進一步建立了單胚胎pg級RNA分析技術平台，建立同體、同型和異型克隆不同時期的胚胎cDNA文庫，並利用包含23,000多個牛轉錄本的Affymetrix晶片對單胚胎的基因表達譜進行分析，通過生物信息學分析得到了基因表達譜聚類結果，初步篩選出4個差異表達基因，並利用設計其RNAi序列，利用小鼠胚胎進行干擾實驗，初步驗證候選基因的功能，系統地探討表觀遺傳修飾對克隆胚胎髮育的作用機理。胚胎幹細胞來自囊胚的內細胞團，早期胚胎髮育的研究也將為胚胎幹細胞的分子機制提供理論基礎。
