克倫特羅化學發光檢測試劑盒

基本介紹

• 中文名：克倫特羅化學發光檢測試劑盒
• 外文名：Clenbuterol
• 簡寫拼音：KLTL
• 所屬類別：平喘藥\β腎上腺素受體激動劑

藥物介紹

b－克侖特羅（clenbuterol，CLE）是一種腎上腺受體激動劑即神經興奮劑。此類藥品在臨床上用於治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等疾病，因此藥可以提高瘦肉率，減少脂肪沉積和促進動物生長，被一些畜牧養殖企業作為養殖促進劑非法使用。其殘留量可導致人體肌肉震顫、心悸、神經過敏、頭痛、目眩、噁心、嘔吐、發燒、戰慄等症狀，對消費者的健康極有危害。現已被明令禁止用於養殖業。HPLC或GC-MS一直用作檢測β興奮劑的方法，但是其前處理步驟費用昂貴。酶聯免疫檢測試劑盒則可經濟、快速地檢測尿，肌肉，肝臟及飼料中的CLE。

基本信息

【中文名稱】：克侖特羅

【簡寫拼音】：KLTL

【英文名稱】：Clenbuterol

【所屬類別】：平喘藥\β腎上腺素受體激動劑

採用原理

化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合，用於各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術。是繼放免分析、酶免分析、螢光免疫分析和時間分辨螢光免疫分析之後發展起來的一項最新免疫測定技術。

分析原理

在化學發光板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中殘留的氯黴素與微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗氯黴素藥物的抗體，加入酶標二抗後，再加入底物用光子計數儀測定各孔的光子計數，光子計數的強度隨氯黴素濃度的升高而逐漸下降，成良好的負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中氯黴素類藥物的殘留量。

實驗所需儀器

（1）微孔板酶標儀450nm/630nm

（2）旋轉蒸發儀/氮氣吹乾裝置

（3）均質器

（4）振盪器

（5）渦旋儀

（6）離心機

檢測方法

試劑盒組成

1、微量測試孔：每條8孔，每板12條

2、克倫特羅標準溶液：

0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05 ppb，1.5ml/瓶

3、96孔化學發光板×1塊 （包被有偶聯抗原）

4、高濃度標準品：（1ml/瓶）1ppm

5、酶標記抗體

6、顯色劑

7、終止液

8、20×濃縮洗滌液

9、2×濃縮復溶液

操作者應該注意之事項

…反應停止液為1M硫酸，避免接觸皮膚

…不要使用過了有效日期的克倫特羅測定試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低

…不要交換使用不同批號的盒中試劑

使用說明

A、注意事項

1、使用前先將克倫特羅標準溶液6瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標記物，底物溶液及微量測試孔條置於室溫下，回溫30分鐘。

2、洗滌工作液

用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋　3、回溫後，取出所需微量測試孔條，將剩餘板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置於4o℃保存。

樣品處理

尿液：離心

組織：用柱層析法預純化。

飼料：酸化，中和離心。

樣品處理需要的時間：（10個樣品）

飼料……………………………60分鐘

尿液……………………………10分鐘

組織……………………………6小時

測試時間： 約1小時

8.1尿樣以2500轉離心10分鐘後取上清部分（清亮部分）用於檢測。若尿樣呈渾濁狀，需先用濾紙過濾，否則會影響測定數值。本試劑盒的標準曲線及計算（採用曲線定量）, 與德國Bio-pharm公司一致。反應體系加液量為20μl樣品: 100μl酶液。（見第4頁尿樣快速檢測程式）。

8.2.1帶有低脂肪的肝，肉，或組織

…5g粉碎的樣品與25ml 50mM HCL 混合，振盪1.5小時，勻漿。

…稱6g勻漿物（相當於1g肝臟），加入離心管中。

…10-15℃以4000轉/分或更高速，離心15分鐘

…轉移上清液到另一個離心管中，加300μl 1MNaOH 混合15分鐘。

…加入4ml 500mM磷酸二氫鉀緩衝液（pH3.0），簡單的混合後放置4℃至少1.5小時或過夜。

…10-15℃以4000轉/分或更高速，離心15分鐘。分離全部上清液（應該是清亮的），使其升至室溫（20-25℃），然後用C18柱純化（見C18柱純化步驟）。

8.2.2 肉和組織

…5g 粉碎的樣品與25ml50mM Tris 緩衝液pH8.5混合，振盪0.5小時，勻漿。

…加入15ml庚烷（n-heptane）振盪5分鐘除去脂肪。

…4000g或更高的速度10-15℃離心5分鐘

…用巴斯德吸管除去上面的庚烷層及中間薄薄的脂肪層

…再用15ml庚烷（n-heptane）重複步驟2-4

…向勻漿的肉液中加入0.5ml半濃的鹽酸，振盪1小時

…稱6g均質物（相當於1g肝臟），加入離心管中。

…以下從8.2.1的第一個離心步驟開始，像處理肝臟一樣繼續進行處理。

C18柱以下列方式純化

所有試劑和樣品處理必須在室溫條件下（20-25℃）並嚴格控制過柱時的流速。

…用3ml甲醇（100%）洗滌柱子，流速為1滴/每秒

…用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩衝液pH3.0）

…樣品進柱（肝，肉，或組織的全部上清液）

…用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩衝液pH3.0）

…用正壓去除殘留的流體並且用空氣或氮氣吹2分鐘乾燥柱子

…用2ml甲醇（100%）洗脫樣品，流速為15滴/分鐘

…在50-60℃並且在弱空氣或氮氣流下完全蒸發溶劑

…用1ml蒸流水溶解乾燥的殘留物，取50μl進行分析

注意：

樣品的保存

…未處理的樣品冷凍保存

…HCL勻漿後的樣品在2-8℃穩定3天

…以磷酸二氫鉀緩衝液提取後的樣品（C18柱純化之前）在2-8℃穩定2天，使用前需離心。

…C18柱純化步驟6所獲得的甲醇洗脫物可以冷凍保存數周，在2-8℃穩定2周。

…用蒸餾水溶解的乾燥殘留物（步驟8）在2-8℃穩定1周。

C、操作步驟

本產品的酶標記物與克倫特羅標準溶液均直接使用，無需再稀釋。

1、於適當微孔中分別加入100mL標準溶液(0,0.05,0.15,0.45,1.35和4.05ppb)。

2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。

3、再於每一微孔中另再加入50mL酶標記物。

4、輕敲盤子四周，使其充分混合後於室溫下避光靜置溫育1小時。

5、將微孔中的反應液甩掉，再將洗液加滿每一微孔後甩掉，重複洗3次。

6、最後一次甩掉後，在吸水紙上拍乾。

7、於每一微孔中加入底物溶液100mL後，輕敲盤子四周，使其充分混合。

8、於室溫下避光靜置溫育20分鐘。

9、於每一微孔中加入100mL反應終止液。

10、用化學發光儀於下判讀。

D、判定

1. 計算B/B0值。用樣品或標準液吸光度值(B)除以零標準吸光度值(B0)再乘以100%。

2. 以B/B0值為縱坐標，以標樣濃度的對數值為橫坐標，做標準半對數曲線。

3. 根據每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。

4. 由於樣品經過了預先稀釋，因此根據標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。

H、再現性

針對克倫特羅檢測試劑盒精密度測試，重複6次，所得不同濃度標準溶液的吸光值變異係數(%CV).

靈敏度

克倫特羅測定試劑盒的平均檢測下限約為0.05ng/g（0.05ppb）。

特異性

與克倫特羅類似物的交叉反應：

克倫特羅(Clenbuterol)100%

特布他林Terbutalin 4%

沙丁胺醇Salbutamol 11%

異丙腎上腺素Isoproterenol <2%

腎上腺素Adrenalin <2%

去甲腎上腺素Noradrenalin <2%

回收率

回收率為90%±15%

試劑變質的跡象

發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之，0標準液的A450nm<0.6時，表示試劑可能變質。

操作者應該注意之事項

…反應停止液為1M硫酸，避免接觸皮膚

…不要使用過了有效日期的克倫特羅測定試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度的降低

…不要交換使用不同批號的盒中試劑