無菌檢查法系用於檢查藥典要求無菌的藥品、醫療器具、原料、輔料、及其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發現微生物污染。
基本介紹
- 中文名：中國藥典無菌檢查法
- 國家：中國
- 行業：藥業
- 類別：辦法
基本信息,檢驗條件,檢驗背景,檢驗人員,方法解釋,培養基,稀釋液沖洗液,方法驗證試驗,無菌檢查,檢驗數量,檢驗量,陽性對照,陰性對照,種培養基,薄膜過濾法,直接接種法,培養及觀察,結果判斷,附表,
基本信息
任何違反《藥品生產質量管理規範》（GMP）或有未經批准添加物質所生產的藥品，即使符合《中國藥典》或按照《中國藥典》沒有檢出其添加物質或相關物質，亦不能認為其符合規定。
檢驗條件
檢驗背景
無菌檢查應在環境潔淨度10000級下的局部潔淨度100級的單向流空氣區域內或隔離系統中進行，其全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區、工作檯面及環境應定期按《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。隔離系統應按相關的要求進行驗證，其內部環境的潔淨度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環境進行監控。
註：《醫藥工業潔淨室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行版國家標準分為：
GB/T16292-2010醫藥工業潔淨室(區)懸浮粒子的測試方法
GB/T16293-2010醫藥工業潔淨室(區)浮游菌的測試方法
GB/T16294-2010醫藥工業潔淨室(區)沉降菌的測試方法
檢驗人員
無菌檢查人員必須具備微生物專業知識，並經過無菌技術的培訓。
方法解釋
以下方法為《中國藥典》2015版第四部1101無菌檢查法。
培養基
培養基的製備及培養條件
培養基可按以下處方製備，亦可使用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。配製後應採用驗證合格的滅菌程式滅菌。製備好的培養基應保存在2℃～25℃、避光的環境，若保存於非密閉容器中，一般在三周內使用；若保存於密閉容器中，一般可在一年內使用。
1．硫乙醇酸鹽流體培養基
無水葡萄糖 5.0g 氯化鈉 2.5g
(或硫乙醇酸) （0.3ml) 水 1000 ml
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調節pH 為弱鹼性，煮沸，濾清，加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH值使滅菌後為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中，其裝量與容器高度的比例應符合培養結束後培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的1/2。滅菌。在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/5 ，否則，須經100 ℃水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次，並防止被污染。
硫乙醇酸鹽流體培養基置30℃～35℃培養。
2．胰酪大豆腖液體培養基
胰酪腖 17.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 3.0g
磷酸氫二鉀 2.5g 水 1000 ml
除葡萄糖外，取上述成分混合，微溫溶解，濾過，調節pH值使滅菌後為7.3±0.2，加入葡萄糖分裝，滅菌。
胰酪大豆腖液體培養基置20℃～25℃培養。
3．中和或滅活用培養基
4．0.5%葡萄糖肉湯培養基（用於硫酸鏈黴素等抗生素的無菌檢查）
腖 10.0g 氯化鈉 5.0g
葡萄糖 5.0g 水 1000 ml
牛肉浸出粉 3.0g
除葡萄糖外取上述成分混合，微溫溶解，調節pH為弱鹼性，煮沸，加入葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後在25℃為7.2±0.2，分裝，滅菌。
5．胰酪大豆腖瓊脂培養基
胰酪腖 15.0g 大豆木瓜蛋白酶水解物 5.0g
氧化鈉 3.0g 瓊脂 15.0g
水 1000 ml
除瓊脂外，取上述成分混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後在25℃為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱溶化後，搖勻，分裝，滅菌。
6．沙氏葡萄糖液體培養基
動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪腖等量混合物 10.0g
葡萄糖 20.0g 水 1000ml
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後在25℃為5.6±0.2，加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。
7．沙氏葡萄糖瓊脂培養基
動物組織胃蛋白酶水解物和胰酪腖等量混合物 10.0g
葡萄糖 40.0g 瓊脂 15.0g 水 1000ml
除葡萄糖、瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調節pH值使滅菌後在25℃為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱溶解，再加入葡萄糖，搖勻，分裝，滅菌。
培養基的適用性檢查
無菌檢查用的硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆腖液體培養基等應符合培養基的無菌性檢查及靈敏度檢查的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。
無菌性檢查 每批培養基隨機取不少於5支（瓶），置各培養基規定的溫度培養14天，應無菌生長。
靈敏度檢查
菌種 培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0代），試驗用菌種應採用適宜的菌種保存技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑麴黴(Aspergillus niger)〔CMCC(F) 98 003〕
菌液製備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至胰酪大豆腖培養基中或胰酪大豆腖瓊脂培養基上，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30℃～35℃培養18小時～24小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，20～25℃培養24～48小時，上述培養物用PH7.0無菌氧化鈉-蛋白腖緩衝液或0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含菌數小於100 cfu（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑麴黴的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，20～25℃培養5～7天，加入3～5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液或0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml含孢子數小於100 cfu的孢子懸液。
菌懸液在室溫下放置應在2小時內使用，若保存在2～8℃可在24小時內使用。黑麴黴孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內使用。
培養基接種 取每管裝量為12ml的硫乙醇酸鹽流體培養基7支，分別接種小於100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，置30～35℃培養3天；取每管裝量為9ml的胰酪大豆腖液體培養基7支,分別接種小於100 cfu的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑麴黴各2支，另1支不接種作為空白對照，20～25℃培養5天。逐日觀察結果。
結果判定 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生長良好，判該培養基的靈敏度檢查符合規定。
稀釋液沖洗液
配製方法
稀釋液、沖洗液配製後應採用驗證合格的滅菌程式滅菌。
1．0.1%無菌蛋白腖水溶液 取蛋白腖1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調節pH值至7.1±0.2，分裝，滅菌。
根據供試品的特性，可選用其他經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液（如0.9%氯化鈉溶液）。
方法驗證試驗
進行產品的無菌檢查法時，應進行方法適用性驗證，以證明所採用的方法適合於該產品的無菌檢查。若該產品的組分或原檢驗條件發生改變時，檢查方法應重新驗證。
驗證時，按“供試品的無菌檢查”的規定及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。
菌種及菌液製備
薄膜過濾法
取每種培養基規定接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最後一次的沖洗液中加入小於100 cfu的試驗菌，過濾。取出濾膜接種至硫乙醇酸鹽流體培養基或胰酪大豆腖液體培養基至濾筒內。另取一裝有同體積培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照。置規定溫度培養3～5天，各試驗菌同法操作。
直接接種法
取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基6管，分別接入小於100 cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2管，取符合直接接種法培養基用量要求的胰酪大豆腖液體培養基6管，分別接入小於100 cfu的白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑麴黴各2管。其中1管接入每支培養基規定量的供試品量，另1管作為對照，按置規定的溫度培養3～5天，各試驗菌同法操作。
結果判斷
與對照管比較，如含供試品各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計，照此檢查方法和檢查條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可採用增加沖洗量、增加培養基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，並重新進行方法驗證試驗。
方法適用性驗證試驗也可與供試品的無菌檢查同時進行。
無菌檢查
無菌檢驗法包括薄膜過濾法跟直接接種法。只要供試品性質允許，應採用薄膜過濾法。供試品無菌檢查所採用的檢查方法跟檢驗條件與方法適用性試驗確認的方法相同。
無菌試驗過程中，若需使用表面活性劑、滅火劑、中和劑等試劑應證明其有效性，且對微生物無毒性。
檢驗數量
檢驗數量是指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數量。除另有規定外，出廠產品按表1規定；上市產品監督檢驗按表2、表3規定。表1、表2、表3中最少檢驗數量不包括陽性對照試驗的供試品用量。一般情況下，供試品無菌檢查若採用薄膜過濾法，應增加1/2的最小檢驗數量作陽性對照用；若採用直接接種法，應增加供試品1支（或瓶）作陽性對照用。
檢驗量
是指一次試驗所用的供試品總量（g或ml）。除另有規定外，每份培養基接種的供試品量按表2、表3規定。若每支（瓶）供試品的裝量按規定足夠接種兩份培養基，則應分別接種硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆腖液體培養基。採用薄膜過濾法時，檢驗量應不少於直接接種法的總接種量，只要供試品特性允許，應將所有容器內的全部內容物過濾。
陽性對照
應根據供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。陽性對照試驗的菌液製備同方法驗證試驗，加菌量小於100cfu，供試品用量同供試品無菌檢查每份培養基接種的樣品量。陽性對照管培養48～72小時應生長良好。
陰性對照
供試品無菌檢查時，應取相應溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。
種培養基
除另有規定外，按下列方法進行供試品處理及接種培養基。
薄膜過濾法
薄膜過濾法 一般應採用封閉式薄膜過濾器，也可使用一般薄膜過濾器。無菌檢查用的濾膜孔徑應不大於0.45μm。直徑約為50mm。根據供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質。抗生素供試品應選擇低吸附的濾器及濾膜。濾器及濾膜使用前應採用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前後的完整性。
水溶性供試液 過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應充分乾燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾後，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量一般為100ml，總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。
水溶液供試品取規定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數一般不少於3次，所用的沖洗量、沖洗方法同方法驗證試驗。除生物製品外，一般樣品沖洗後，1份濾器中加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養基，1份濾器中加入100ml胰酪大豆腖培液體養基。生物製品樣品沖洗後，2份濾器中加入100ml硫乙醇酸鹽流體培養基，1份；v起加入100ml胰酪大豆腖液體培養基容器中。
水溶性固體製劑供試品 取規定量，加適宜的稀釋液溶解或按標籤說明復溶，然後照水溶液供試品項下的方法操作。
非水溶性製劑供試品 取規定量，直接過濾；或混合溶於含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含0.1～1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜至少3次。濾膜於含或不含聚山梨酯80的培養基中培養。接種培養基照水溶液供試品項下的方法操作。
可溶於十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品 取規定量，混合至適量的無菌十四烷酸異丙酯①中，劇烈振搖，使供試品充分溶解，如果需要可適當加熱，但溫度不得超過44℃，趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品，於含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試液中加入不少於100ml的稀釋液，充分振搖萃取，靜置，取下層水相作為供試液過濾。過濾後濾膜沖洗及接種培養基照非水溶性製劑供試品項下的方法操作。
無菌氣（噴）霧劑供試品 取規定量，將各容器置－20℃或其他適宜溫度冷凍約1小時，取出，以無菌操作迅速在容器上端鑽一小孔，釋放拋射劑後再無菌開啟容器，並將供試液轉移至無菌容器中，然後照水溶液或非水溶性製劑供試品項下的方法操作。
裝有藥物的注射器供試品 取規定量，排出注射器中的內容物置無菌容器中，若需要可吸入稀釋液或標籤所示的溶劑溶解，然後照水溶液或非水溶性製劑供試品項下的方法操作。同時應採用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢查。
具有導管的醫療器具(輸血、輸液袋等)供試品 取規定量，每個最小包裝用50～100ml沖洗液分別沖洗內壁，收集沖洗液於無菌容器中，然後照水溶液供試品項下方法操作。同時應採用直接接種法進行包裝中所配帶的針頭的無菌檢查。
直接接種法
直接接種法 適用於無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品，即取規定量供試品分別接種至各含硫乙醇酸鹽流體培養基和胰酪大豆腖液體培養基中。除生物製品外，一般樣品吳軍檢查時兩種培養基接種的瓶或支數相等；生物製品無菌檢查時硫乙醇酸鹽液體培養基和胰酪大豆腖液體培養基接種的瓶或支數為2：1.除另有規定外，每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積不得大於培養基體積的10%，同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少於15ml，胰酪大豆腖液體培養基每管裝量不少於10ml。供試品檢查時，培養基的用量和高度同方法驗證試驗。
混懸液等非澄清水溶液供試品取規定量，等量接種至各管培養基中。
固體製劑供試品取規定量，直接接種至各管培養基中。或加入適宜的溶劑溶解，或按標籤說明復溶後，取規定量接種至各管培養基中。
非水溶性製劑供試品 取規定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其它適宜的乳化劑及稀釋劑使其乳化，接種至各管培養基中。或直接接種至含聚山梨酯80或其它適宜乳化劑的各管培養基中。
腸線、縫合線等供試品 腸線、縫合線及其它一次性使用的醫用材料按規定量取最小包裝，無菌拆開包裝，接種於各管足以浸沒供試品的適量培養基中。
滅菌醫用器具供試品 取規定量，必要時應將其拆散或切成小碎段，等量接種於足以浸沒供試品的適量培養基中。
培養及觀察
上述含培養基的容器按規定的溫度培養14天。接種生物製品供試品的硫乙醇酸鹽流體培養基的容器應分為兩等分，一份置30~35℃培養，一份置20~25℃培養。培養期間應逐日觀察並記錄是否有菌生長，如在加入供試品或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中，培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基是否再出現渾濁；或取培養液塗片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。
結果判斷
陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則，試驗無效。
若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定；若供試品管中任何一管顯渾濁並確證有菌生長，判供試品不符合規定，除非能充分證明試驗結果無效，即生長的微生物非供試品所含。當符合下列至少一個條件時方可判試驗結果無效：
⑴無菌檢查試驗所用的設備及環境的微生物監控結果不符合無菌檢查法的要求。
⑵回顧無菌試驗過程，發現有可能引起微生物污染的因素。
⑶供試品管中生長的微生物經鑑定後，確證是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術不當引起的。
試驗若經確認無效，應重試。重試時，重新取同量供試品，依法檢查，若無菌生長，判供試品符合規定；若有菌生長，判供試品不符合規定。
附表
表1 批出廠產品及生物製品的原液和半成品最少檢驗數量
供試品 | 批產量N（個） | 接種每種培養基所需的最少檢驗數量 |
注射劑 大體積注射劑（>100 ml） | ≤100 100<N≤500 >500 | 10%或4個（取較多者） 10個 2%或20個（取較少者） 2%或10個（取較少者） |
凍乾血液製品 >5ml ≤5ml | 每櫃凍乾≤200 每櫃凍乾>200 ≤100 100<N≤500 >500 | 5個 10個 5個 10個 20個 |
眼用及其他非注射產品 | ≤200 >200 | 5%或2個（取較多者） 10個 |
桶裝無菌固體原料 抗生素固體原料藥（≥5克） | ≤4 4<N≤50 >50 | 每個容器 20%或4個容器（取較多者） 2%或10個容器（取較多者） 6個容器 |
生物製品原液或半成品 | 每個容器（每個容器製品的取樣量為 總量的0.1%或不少於10ml，每開瓶一 次，應如上法抽樣） | |
體外用診斷製品半成品 | 每批（抽驗量應不少於3ml） | |
醫療器具 | ≤100 100<N≤500 >500 | 10%或4件（取較多者） 10件 2%或20件（取較少者） |
註：若供試品每個容器內的裝量不夠接種兩種培養基，那么表中的最少檢驗數量應增加相應倍數。
表2 上市抽驗樣品的最少檢驗數量
品種及裝量（V） | 最少抽驗量 |
液體製劑 | 10 |
固體製劑 | 10 |
6 2 | |
醫療器具 | 10 |
註：①若供試品每個容器內的裝量不夠接種兩種培養基，那么表中的最少檢驗數量應增加相應倍數。
②抗生物粉針劑(≥5g)及抗生物原料藥(≥5g)的最少檢驗數量為6瓶(或支)。桶裝固體原料的最少檢驗數量 為4個包裝。
表3 供試品的最少檢驗量
供試品 | 供試品裝量 | 每支（瓶）供試品接入每種 培養基的最少接種量 |
液體製劑 | ≤1ml 1ml<V≤40ml 40ml<V≤100ml V>100ml | 全量 半量，但不得少於1ml 20ml 10%但不少於20ml |
固體製劑 | M <50mg 50mg≤M<300mg 300mg≤M<5g M≥5g | 全量 半量 150mg 半量 |
生物製品的原液及半成品 | 半量 | |
醫療器具 | 外科用敷料棉花及紗布 縫合線、一次性醫療材料 帶導管的一次性醫療器具(如輸液袋) 其他醫療器具 | 取100mg或1cmX3cm 整個材料① 二分之一內表面積 整個器具①(切碎或拆散開) |
①如果醫療器械體積過大，培養基用量可在2000ml以上，將其完全浸沒。
