trp操縱子

trp操縱子是負責色氨酸合成的操縱子。trp操縱子是由一個啟動子和一個操縱基因區組成。該操縱基因控制一個編碼色氨酸生物合成需要的5種蛋白的多順反子mRNA的表達。

基本介紹

• 中文名：trp操縱子
• 負責：色氨酸合成
• 性質：操縱子
• 組成：一個啟動子和一個操縱基因區

代謝工程理論與色氨酸操縱子調控研究

基本結構合成摘要色氨酸操縱子(tryptophane operon)負責色氨酸的生物合成，當培養基中有足夠的色氨酸時，這個操縱子自動關閉，缺乏色氨酸時操縱子被打開，trp基因表達，色氨酸或與其代謝有關的某種物質在阻遏過程（而不是誘導過程）中起作用。由於trp體系參與生物合成而不是降解，它不受葡萄糖或cAMP-CAP的調控。

合成

色氨酸分5步完成。每個環節需要一種酶，編碼這5種酶的基因緊密連鎖在一起，被轉錄在一條多順反子mRNA上，分別以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，編碼了鄰氨基苯甲酸合成酶、鄰氨基苯甲酸焦磷酸轉移酶、鄰氨基苯甲酸異構酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酶合成酶。

trpE基因是第一個被翻譯的基因，和trpL和trpa（不是trpA）。trp操縱子中產生阻遏物的基因是trpR，該基因距trp基因簇很遠，後者在大腸桿菌染色體圖上25min處，而前者則位於90min處。在位於65min處還有一個trpS（色氨酸tRNA合成酶），它和攜帶有trp的tRNATrp也參與trp操縱子的調控作用。

基本結構

大腸桿菌色氨酸操縱子結構較簡單,也是研究得最清楚的操縱子,結構基因依次排列為trpEDC2BA ,其中trpGD 和trpCF 基因融合。trpE和trpG編碼鄰氨基苯甲酸合酶, trpD編碼鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉移酶, trpC編碼吲哚甘油磷酸合酶, trpF編碼異構酶, trpA和trpB分別編碼色氨酸合酶的α和β亞基。trpE的上游為調控區,由啟動子、操縱基因和162bp 的前導序列組成。5 個結構基因全長約6800bp, trpD遠側還有一個二級啟動子,在細胞生長需要過量Trp時發揮作用。一些G 菌,如枯草桿菌色氨酸操縱子的結構有所不同, 7 個結構基因中的6 個依次排列為trpEDCFBA ,存在於含有12個結構基因的芳香族胺基酸超操縱子( a ro operon ) ,第7 個結構基因, trpG存在於葉酸合成操縱子中,該酶參與Trp 和葉酸的合成。有2個啟動子參與調控,一個位於aro operon的起始位置, 另一個則位於trpE 上游約200 bp處。

調控作用途徑

Trp合成途徑較漫長,消耗大量能量和前體物,如絲氨酸、PRPP、谷氨醯氨等,是細胞內最昂貴的代謝途徑之一,因此受到嚴格調控,其中色氨酸操縱子發揮著關鍵作用。調控作用主要有三種方式:阻遏作用、弱化作用以及終產物Trp 對合成酶的反饋抑制作用。

阻遏作用

trp操縱子轉錄起始的調控是通過阻遏蛋白實現的1～2 ×10- 5 moloL - 1。產生阻遏蛋白的基因是trpR ,該基因距trp o2peron基因簇很遠。它結合於trp 操縱基因特異序列,阻止轉錄起始。但阻遏蛋白的DNA結合活性受Trp調控, Trp起著一個效應分子的作用, Trp與之結合的動力學常數為。在有高濃度Trp存在時,阻遏蛋白- 色氨酸複合物形成一個同源二聚體,並且與色氨酸操縱子緊密結合,因此可以阻止轉錄。阻遏蛋白- 色氨酸複合物與基因特異位點結合的能力很強,動力學常數為2 ×10- 10mol·L - 1 ,因此細胞內阻遏蛋白數量僅有20～30分子已可充分發揮作用。當Trp 水平低時,阻遏蛋白以一種非活性形式存在,不能結合DNA。在這樣的條件下, trp操縱子被RNA聚合酶轉錄,同時Trp 生物合成途徑被激活。

弱化作用

trp操縱子轉錄終止的調控是通過弱化作用（衰減作用）( attenuation)實現的。為什麼trp操縱子需要這種額外的調控機制？可能的原因在於trp操縱子的阻遏作用實質上是一種弱調控機制，即使有阻遏物存在的情況下，trp操縱子仍能發生大量的轉錄事件。事實上，在阻遏調控系統和衰減調控系統的共同作用下，可以在700倍左右範圍內對trp操縱子的轉錄活性進行調控。這十分經濟有效，因為色氨酸的合成需要消耗大量地能量。

在大腸桿菌trp operon,前導區的鹼基序列包括4個分別以1、2、3和4表示的片段,能以兩種不同的方式進行鹼基配對, 1 - 2和3 -4配對,或2 - 3配對, 3 - 4配對區正好位於終止密碼子的識別區。前導序列有相鄰的兩個色氨酸密碼子,當培養基中Trp 濃度很低時,負載有Trp 的tR2NATrp也就少,這樣翻譯通過兩個相鄰色氨酸密碼子的速度就會很慢,當4區被轉錄完成時,核糖體滯留1區,這時的前導區結構是2 - 3配對,不形成3 - 4配對的終止結構,所以轉錄可繼續進行。反之,核糖體可順利通過兩個相鄰的色氨酸密碼子,在4區被轉錄之前,核糖體就到達2區,這樣使2 - 3不能配對, 3 - 4 區可以配對形成終止子結構, 轉錄停止。枯草桿菌的弱化作用機制另有特點。因其色氨酸操縱子結構的特殊性,轉錄起始的調節似乎不如轉錄終止的調節更具重要性。枯草桿菌色氨酸操縱子表達主要受到色氨酸激活RNA結合蛋白( Trp -activated RNA - binding p rotein, TRAP)的調節。該蛋白與色氨酸結合被激活後,可與trpE上游轉錄產物結合, 導致轉錄終止。當色氨酸濃度較低時,TRAP失活,轉錄可以繼續,結構基因得以表達。另外枯草桿菌對未負荷色氨酸的tRNATrp也很敏感,後者大量堆積, 會誘導合成抗TRAP 蛋白( anti -PRAP, AT) 。AT與Trp激活的PRAP結合,可以取消其轉錄終止活性。trpG表達也受PRAP調控,活化的TRAP與和trpG相重疊的S - D 序列結合,阻礙核糖體的結合,抑制trpG轉錄。

反饋抑制作用

由於基因表達必然消耗一定的能源和前體物,相對於阻遏和弱化作用,反饋抑制作用更為經濟和高效。終產物Trp對催化分支途徑幾步反應的酶具有反饋抑制作用,其50%抑制濃度分別為:鄰氨基苯甲酸合酶, 0. 0015 mmol·L - 1 ;鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉移酶, 0. 15 mmol·L - 1 ; 色氨酸合成酶, 7. 7mmol·L - 1 。對於普通野生菌株,鄰氨基苯甲酸合酶對Trp合成起到關鍵調控作用,常被稱為瓶頸酶;但對高產Trp工程菌而言,上述任何一種酶的反饋抑制都會直接影響Trp產量。研究發現酶蛋白某些特殊位點突變可以導致對反饋抑制作用敏感性顯著下降,如鄰氨基苯甲酸合酶38位的絲氨酸被精氨酸取代,抗反饋抑制能力顯著提高,當環境中Trp濃度為10 mmol·L - 1時酶活性不受影響,而相同條件下野生型酶活性不到1%。鄰氨基苯甲酸磷酸核糖轉移酶162位纈氨酸被谷氨酸取代,抗反饋抑制能力也有顯著提高,當環境中含有0. 83 mmol·L - 1色氨酸或0. 32 mmol·L - 1 5 - 甲基- 色氨酸時,酶活性分別為野生菌的3. 6倍和2. 4倍。陳小芳等報導一株谷氨酸棒桿菌鄰氨基苯甲酸合酶基因7個鹼基突變導致6個胺基酸殘基改變,抗反饋抑制能力顯著增強,環境中Trp 濃度達到15 mmol·L - 1時,鄰氨基苯甲酸合酶活性幾乎沒有變化。

遺傳改造

由於色氨酸操縱子的調控作用,自然界不可能存在高產Trp菌株,為了獲得高產Trp菌株,就必須對色氨酸操縱子進行改造,解除其調節作用。早期的研究策略主要依靠傳統誘變方法,經過長期努力,獲得了一些有價值的研究結果,如獲得了TrpR - 菌株,通過缺失某些片斷解除了弱化作用,得到了一些抗反饋抑制的酶。許多Trp生產菌株都是通過隨機的誘變技術篩選得到的,如王健等通過硫酸二乙酯誘變, Trp 類似物篩選等方法從谷氨酸棒桿菌中培育出一株trp 高產菌株,搖瓶發酵64 h,產trp達到7. 28 g·L - 1。

傳統誘變的方法儘管有效,但其缺陷點也是顯而易見的,如工作量大,效率低,突變株的菌體生長、對環境的耐受性以及遺傳穩定性等都比野生型菌株差等。基因工程技術的建立和發展對色氨酸操縱子改造提供了新的技術平台。1979年Tribe等人採用DNA重組技術對大腸桿菌進行改造,擴增trp 操縱子,發酵12 h,產酸1 g·L - 1 ,產酸量儘管不是很高,但是其意義卻十分重大,由此開創了基因工程技術在Trp生物合成套用的先河。隨後,Aiba等將帶有色氨酸操縱子的質粒引入大腸桿菌,發酵27 h,並補充鄰氨基苯甲酸,得到trp 6. 2 g·L - 1 。Ikeda等通過構建穩定質粒,擴增分支途徑限速酶並改造中心代謝途徑, 獲得產Trp 達58 mg ·L - 1 的菌株。除了擴增表達操縱子基因,對其進行理性設計和改造也開始引起關注。已知酶分子某些特殊位點突變可以導致對反饋抑制作用敏感性下降,因此可以考慮利用基因工程技術對色氨酸操縱子結構基因進行理性改造降低其對反饋抑制的敏感性,但是目前尚缺乏成功的範例,主要原因在於現有酶分子反饋抑制結構與功能關係資料不足,不能滿足需要。

代謝工程理論與色氨酸操縱子調控研究

1991年,Bailey用代謝工程描述利用DNA重組技術對細胞的酶反應、物質運輸以及調控功能的遺傳操作,進而改良細胞生物活性的過程,標誌著代謝工程向一門系統學科發展的轉折點。代謝工程亦稱途徑工程,以區別於傳統的單基因表達(第一代基因工程)和基因定向突變(第二代基因工程) ,是有目的地對細胞生化反應的代謝網路進行修飾的技術,在多基因水平上設計修飾細胞固有的代謝途徑和遺傳性狀,並賦予細胞更為優越甚至嶄新的產物生產品質。代謝工程在提高宿主細胞原有代謝物的產量、產生新物質、擴展和構建新代謝途徑、生產代謝產物如胺基酸、抗生素、維生素以及降解環境污染物等諸多方面顯示出廣闊的套用前景。從理論上提高Trp產率是代謝工程的首要任務,這需要對Trp生物合成和對細胞內控制Trp 代謝的異化途徑有很好的了解,同時還要有一個在較寬的微生物代謝網路內描述這些途徑的有效的數學模型。早期的模型主要考慮色氨酸操縱子動力學的某個方面,僅有少數研究模型,綜合考慮了色氨酸操縱子的三種作用機制。修志龍等將代謝工程理論引入trp代謝分析領域,建立了適宜的數學模型,發現在代謝穩定的條件下,阻遏水平和酶的反饋抑制強度嚴重地影響了目標變數,即trp 濃度。Santillan等人提出的動力模型採用Second Lyapunov’s method分析,通過對野生菌株和幾株改良菌株(鄰氨基苯甲酸合成酶反饋抑制和弱化作用分別解除)的性能進行比較、驗證,得出結論認為酶的反饋抑制對於系統穩定性具有重要作用,而弱化作用影響較小,主要在Trp營養發生改變時發生作用。這兩個模型有一定的代表性,它們考慮了酶的反饋抑制,對於Trp生物合成具有一定指導意義;但其不足也很明顯,僅僅考慮了鄰氨基苯甲酸合成酶的反饋抑制作用,對其它酶未作考慮,另外一個不足是缺乏高產色氨酸菌株來加以驗證。