piggybac

PiggyBac(PB)轉座子來源於 鱗翅目昆蟲,最初是在研究桿狀病毒(Baculovirus)侵襲粉紋夜蛾細胞系TN-368時首次發現並分離到的。在分類上屬於真核生物的第二類轉座子,是一個自主因子,長2 476 bp,有短的末端反向重複序列(ITR)和一個開放編碼框(ORF),ITR長13bp,ORF長2.1kb。PB轉座子主要採取“cut-paste”機制發生轉座。PB系統轉座效率高,宿主範圍廣,廣泛套用於昆蟲等低等生物的基因轉移及突變篩選。利用PB轉座子構成的載體-輔助質粒系統已成功地獲得了轉基因地中海果蠅、黑腹果蠅和家蠶。PB轉座子具有廣泛的轉座活性,較少地依賴於宿主因子即可實現高效轉座。近年來,研究發現PB系統在哺乳動物及其細胞中也具有高效的轉座活性,已在動物基因組功能研究、基因轉移及誘導多能幹細胞等領域得到了廣泛套用。

基本介紹

  • 外文名:piggybac
  • 縮寫:PB
  • 來源於:鱗翅目昆蟲
  • 首次發現於:研究桿狀病毒侵襲粉紋夜蛾細胞
PB系統結構,轉座機制,特性,PB系統的進化,

PB系統結構

PB全長2 472 bp,兩端各有一個13 bp和19 bp的反向末端重複序列(inverted terminal repeat, ITR),中間編碼一個長594個胺基酸殘基的轉座酶。根據轉座酶的轉錄方向來區分轉座子的兩個末端,兩端最外側各有長13 bp並且對稱的ITR,內側各有一段間隔區(spacer),但並不對稱(左端長3 bp,右端長31bp),再靠內側是各長19 bp且對稱的亞末端反向重複序列(subterminal inverted repeat, STR)。反向重複序列的5'有2~3個C鹼基,對應3'端的G鹼基在選擇剪下位點過程中均起作用。左側LTR只有長於311 bp,並且右側LTR長於235 bp的PB轉座子才具有轉座活性。轉座子左右兩個末端組合研究表明僅有“左+右”及“右+左”具有轉座活性,前者轉座活性為後者的4.6倍,昆蟲中具有啟動子作用的左末端重複序列在哺乳動物中也具有類似功能。還有研究發現PB轉座子的右末端重複序列具有增強子功能。對PB轉座酶的268、346、447及450位置的天冬氨酸進行定點突變研究表明,四個天冬氨酸均是PB轉座剪下所必需的,但是450位置的天冬氨酸突變對轉座酶的活性影響較小。Cadinanos和Bradley對PB轉座酶進行鼠源密碼子最佳化,轉座活性提高了近10倍,還通過轉座酶與雌激素應答原件(ERT2)融合實現了對PB轉座事件的可控性。
PB轉座系統結構PB轉座系統結構

轉座機制

轉座時轉座酶通過與轉座子末端結合形成短暫的髮夾結構,轉座子完全切離後,通過其3'OH末端攻擊靶DNA序列中TTAA位點的5'末端,轉座子5'序列的TTAA懸垂與靶DNA打開的單鏈TTAA相配對,與整合位置兩側的空隙重新連線,連線過程不需要合成DNA。PB轉座酶的這種轉座方式表明,雖然它與DDE(兩個天冬氨酸和一個谷氨酸組成的具有轉座酶活性的區域)重組酶家族沒有序列同源性,但是類似的轉座機制仍表明它是該家族中的一員。
PB轉座及切離修復機制PB轉座及切離修復機制

特性

整合位點
PB轉座系統的插入位點為TTAA,但不是AT富含區。對100隻小鼠的PB整合位點進行研究,發現67%的整合位點位於基因內部或預測基因內。在小鼠ES細胞中的研究表明,PB具有較高的轉座效率,且PB系統發生再次轉座後更傾向於插入基因內部,無local hopping現象。
精確切離
絕大多數的轉座系統轉座後會在原位置缺失或增加幾個鹼基,不能使原位置突變的基因完全恢復至原始狀態,而PB轉座系統則能實現準確切離。最近,利用PB系統將Oct4、Sox2、Klf4及Myc四種基因轉移至體細胞中,成功獲得了iPS,再通過轉座酶的再次轉染將四種基因從染色體中精確切離,得到了不含任何外源基因的iPSC,解決了多能幹細胞的安全性問題。
甲基化抑制PB轉座子活性
Yusa等發現在SB轉座系統中,將甲基化的轉座子和無甲基化的轉座子分別重組到染色體的相同區域,導入轉座酶質粒後發現前者比後者的轉座效率提高了100倍。而PB轉座子經過甲基化後,
轉座酶的可塑性
轉座子元件發生轉座時可將外源基因帶入宿主基因組中,實現外源基因的穩定整合和表達,這種特徵為轉基因動物的製備或基因治療提供了條件,但轉座子整合位點的不可預見性給基因治療的安全套用帶來了巨大障礙。有人嘗試對轉座酶進行修飾,期望實現特異位點的整合,將Gal4的DNA結合域通過一段18~21個胺基酸的linker連結分別與SB11、PB及Tol2系統轉座酶的N端相融合,發現PB轉座系統仍然具有92.2%的轉座活性,而Tol2系統幾乎喪失了轉座能力,僅有原轉座活性的0.267%,SB融合系統則完全失去轉座活性,這為PB系統的定向整合提供了可能。

PB系統的進化

在現有的基因組和EST序列中發現了50餘種與PB相似的序列,來源涵蓋了真菌、植物、昆蟲、甲殼綱、尾索動物、兩棲類、魚類和哺乳動物等,這些序列有的已經被內化成為宿主的一部分,有的兩側帶有TTAA四鹼基重複。在人類基因組中發現了五個含有相似序列的基因及MER85和MER75家族等。雖然僅憑這些序列與PB的相似性還無法確定它們與PB轉座子的親緣關係,但這表明PB系統的進化歷史遠比我們原先想像的要複雜。最近對靈長類基因組中的piggyBac家族進行研究表明,PB家族並非在3 700萬年前就失去了活性,而是自4 000萬年以來就有活性,可能失活不久;此外在猴亞目基因組中還發現了新的PB家族成員,這表明PB家族可能主要是通過水平傳遞方式在此基因組內進化。

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