基本介紹
實驗流程,技術優勢,套用領域,
轉錄組是某個物種或者特定細胞類型產生的所有轉錄本的集合。轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構，揭示特定生物學過程以及疾病發生過程中的分子機理，已廣泛套用於基礎研究、臨床診斷和藥物研發等領域。基於Illumina高通量測序平台的轉錄組測序技術使能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，在分析轉錄本的結構和表達水平的同時，還能發現未知轉錄本和稀有轉錄本，精確地識別可變剪下位點以及cSNP（編碼序列單核苷酸多態性），提供最全面的轉錄組信息。相對於傳統的晶片雜交平台，轉錄組測序無需預先針對已知序列設計探針，即可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，提供更精確的數位化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測範圍，是目前深入研究轉錄組複雜性的強大工具。
實驗流程
樣品提取總RNA後，對於真核生物，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，對於原核生物，用試劑盒去除rRNA，向得到的mRNA中加入Fragmentation Buffer使其片斷成為短片段，再以片斷後的mRNA為模板，用六鹼基隨機引物(random hexamers)合成cDNA第一鏈，並加入緩衝液、dNTPs、RNase H 和DNA polymerase I 合成cDNA第二鏈，經過QiaQuick PCR試劑盒純化並加 EB緩衝液洗脫經末端修復、加鹼基A，加測序接頭，再經瓊脂糖凝膠電泳回收目的大小片段，並進行PCR擴增，從而完成整個文庫製備工作，構建好的文庫用Illumina HiSeq2000進行測序。
技術優勢
數位化信號：直接測定每個轉錄本片段序列，單核苷酸解析度的精確度，同時不存在傳統微陣列雜交的螢光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題。
高靈敏度：能夠檢測到細胞中少至幾個拷貝的稀有轉錄本。
全基因組分析：可以對任何物種進行全基因組分析。無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進行轉錄組分析。同時能夠檢測未知基因，發現新的轉錄本，並精確地識別可變剪下位點及cSNP，UTR區域。
檢測範圍：高於6個數量級的動態檢測範圍，能夠同時鑑定和定量稀有轉錄本和正常轉錄本。
套用領域
轉錄本結構研究(基因邊界鑑定、可變剪下研究等)，轉錄本變異研究(如基因融合、編碼區SNP研究)，非編碼區域功能研究(Non-coding RNA、microRNA前體研究等)，基因表達水平研究以及全新轉錄本發現。
