RFLP是發展最早的DNA標記技術。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點上鹼基的插入、缺失、重排或點突變所引起的。RAPD 技術是1990 年發明並發展起來的，RAPD是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基礎之上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態性分析的分子技術。其以基因組DNA為模板， 以單個人工合成的隨機多態核苷酸序列( 通常為10 個鹼基對) 為引物，在熱穩定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下，進行PCR 擴增。擴增產物經瓊脂糖或聚丙烯醯胺電泳分離、溴化乙錠染色後，在紫外透視儀上檢測多態性。
基本介紹
- 中文名：RFLP和RAPD技術
- 外文名：Restriction Fragment Length Polymorphism
- 研究：物種進化不可缺少的工具
- 進行：基因組研究的基礎
第一節 概 述,第二節 RFLP技術,材料,設備,試劑：,操作步驟,第三節 RAPD技術,材料,設備,試劑,操作步驟：,RAPD技術原理及特點,RAPD分析的優越性和不足,RAPD技術本身存在的問題及對策,
第一節 概 述
遺傳標記是研究物種進化不可缺少的工具,遺傳學和育種學更離不開遺傳標記;遺傳標記的每次進步都會使這些相關學科有一個飛躍式發展。分子生物學發展的產物DNA標記技術為物種起源、進化、分類以及生物遺傳育種等研究帶來新的曙光。DNA分子水平上的多態性檢測技術是進行基因組研究的基礎。RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段長度多態性)已被廣泛用於基因組遺傳圖譜構建、基因定位以及生物進化和分類的研究。RFLP是根據不同品種（個體）基因組的限制性內切酶的酶切位點鹼基發生突變，或酶切位點之間發生了鹼基的插入、缺失，導致酶切片段大小發生了變化，這種變化可以通過特定探針雜交進行檢測，從而可比較不同品種（個體）的DNA水平的差異（即多態性），多個探針的比較可以確立生物的進化和分類關係。所用的探針為來源於同種或不同種基因組DNA的克隆，位於染色體的不同位點，從而可以作為一種分子標記(Mark)，構建分子圖譜。當某個性狀（基因）與某個（些）分子標記協同分離時，表明這個性狀（基因）與分子標記連鎖。分子標記與性狀之間交換值的大小，即表示目標基因與分子標記之間的距離，從而可將基因定位於分子圖譜上。分子標記克隆在質粒上，可以繁殖及保存。不同限制性內切酶切割基因組DNA後，所切的片段類型不一樣，因此，限制性內切酶與分子標記組成不同組合進行研究。常用的限制性內切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子標記則有幾個甚至上千個。分子標記越多，則所構建的圖譜就越飽和。構建飽和圖譜是RFLP研究的主要目標之一。
運用隨機引物擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，隨機擴增的多態性DNA)。儘管RAPD技術誕生的時間很短, 但由於各種的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透於基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯醯胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對於任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度範圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外，RAPD片段克隆後可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。
本實驗將學習RFLP的酶切,電泳和膜的製作以及RAPD技術。探針標記及雜交檢測方法請另詳見分子雜交技術。
第二節 RFLP技術
RFLPs標記限制性片斷長度多態性(Restriction Fragment length Polymorphism，RnPs)標記，作為遺傳分析的工具，開始於1974年，從20世紀80年代開始於植物，是較早套用於基因標記的一項分子技術。RFLP標記是由於不同基因型之中內切酶位點的鹼基插入、缺失、重組或突變，利用限制內切酶消化基因組DNA時，會產生大小不同的DNA片段，電泳後通過Southem印跡雜交，將這些大小不同的DNA片段轉移到硝酸纖維膜或尼龍膜上，然後用特異的探針進行雜交，最後通過放射性自顯影或其他顯色技術顯示雜交結果，從而揭示出DNA的多態性。RFLP標記…是最早用於構建遺傳圖譜的DNA分子標記，截至目前，各種作物的遺傳圖譜中RFLP標記占大多數。其優點是：無表型效應，其檢測不受環境條件和發育階段影響；共顯性，可以區別純合基因型和雜合基因型；可利用的探針很多，可以檢測到很多遺傳位點。缺點是對DNA質量要求高，需要量大，操作複雜，通常要接觸放射性 。
材料
基因組DNA(大於50kb,分別來自不同的材料)。
設備
電泳儀及電泳槽， 照相用塑膠盆5隻，玻璃或塑膠板(比膠塊略大) 4塊，吸水紙若干，尼龍膜(依膠大小而定)，濾紙 ，eppendorf管(0.5ml)若干。
試劑：
1、限制性內切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切緩衝液。
2、5×TBE電泳緩衝液：配方見第一章。
3、變性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方見第九章。
6、其它試劑：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。
操作步驟
1. 基因組DNA的酶解
(1) 大片斷DNA的提取詳見基因組DNA提取實驗,要求提取的DNA分子量大於50kb, 沒有降解。
(2) 在50μl反應體系中,進行酶切反應:
5μg基因組DNA
5μl 10×酶切緩衝液
20單位（U）限制酶(任意一種)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 輕微振盪, 離心,37℃反應過夜。
(4) 取5μl反應液,0.8%瓊脂糖電泳觀察酶切是否徹底，這時不應有大於30kb的明顯亮帶出現。
[注意] 未酶切的DNA要防止發生降解, 酶切反應一定要徹底。
2. Southern轉移
（1） 酶解的DNA經0.8%瓊脂糖凝膠電泳(可18V過夜)後EB染色觀察。
（2） 將凝膠塊浸沒於0.25mol/L HCl中脫嘌呤, 10分鐘。
（3） 取出膠塊, 蒸餾水漂洗, 轉至變性液變性45分鐘。經蒸餾水漂洗後轉至中和液中和30分鐘。
（4） 預先將尼龍膜,濾紙浸入水中,再浸入10×SSC中,將一玻璃板架於盆中鋪一層濾紙(橋)然後將膠塊反轉放置,蓋上尼龍膜,上覆二層濾紙,再加蓋吸水紙,壓上半公斤重物, 以10×SSC鹽溶液吸印,維持18-24小時。也可用電轉移或真空轉移。
（5） 取下尼龍膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速轉至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分鐘。
（6） 將膜夾於2層濾紙內, 80℃真空乾燥2小時。
（7） 探針的製備和雜交見第九章分子雜交部分。
[注意] 1、 步驟（2）中脫嘌呤時間不能過長。
2、 除步驟（1）、（4）、（5）外, 其餘均在搖床上進行操作。
3、步驟（4）中,當尼龍膜覆於膠上時, 絕對防止膠與膜之間有氣泡發生, 加蓋濾時也不應有氣泡發生。
4、有時用一種限制性內切酶不能發現RFLP的差異，這時應該試用另一種酶。
第三節 RAPD技術
RAPDs標記 隨機擴增多態性(Random Amplified PolymorphicDNA，RAPDs)標記是Williams等於1990年建立的通常以1O鹼基的寡核苷酸序列為引物，對基因組DNA隨機擴增，從而得到多態性圖譜作為遺傳標記的方法。與RFLP相比，RAPD的優點是對DNA質量要求不高，需要量極少，操作簡單易行，不需要接觸放射性，一套引物可用於不同生物的基因組分析，檢測整個基因組，兩條引物配對使用，能產生新的帶型，
— 4 —江蘇農業科學2003年第2期可以找到更多的標記，但不足之處是，絕大部分RAPD是顯型標記，不能區分基因型是純合或是雜合的，每個標記提供的信息量少，再者重複性差。RAPD標記一般為重複序列，若不是重複系列，也可將其轉化為RFLP標記，進一步檢測RAPD分析的結果。
材料
不同來源的DNA(50ng/ul)。
設備
PCR儀，PCR管或矽化的0.5ml eppendorf管，電泳裝置。
試劑
1、隨機引物(10mer) (5umol/L)：購買成品。
2、Taq酶：購買成品。
3、10xPCR 緩衝液：配方見第八章。
4、MgCl2 ：25mmol/L。
5、dNTP：每種2.5mmol/L。
操作步驟：
1. 在25ul反應體系中,加入
模板DNA 1ul (50ng)
隨機引物 1ul (約5pmol)
10xPCR Buffer 2.5ul
MgCl2 2ul
dNTP 2ul
Taq酶 1單位（U）
加ddH2O 至 25ul
混勻稍離心, 加一滴礦物油。
2. 在加熱至90℃以上的PCR儀中預變性94℃ 2分鐘, 然後循環: 94℃ 1分鐘， 36℃ 1分鐘， 72℃ 1分鐘，共40輪循環。
3. 循環結束後, 72℃ 10分鐘，4℃保存。
4. 取PCR產物15ul加3ul上樣緩衝液(6x)於2% 瓊脂糖膠上電泳, 穩壓50-100V（電壓低帶型整齊， 解析度高）。
5. 電泳結束，觀察、拍照。
[注意] 1、電泳時一般RAPD帶有5-15條, 大小0.1-2.0kb。
2、 特異性的DNA帶可以克隆作為一個新的分子標記套用。
RAPD技術原理及特點
原理RAPD技術是建立在PCR技術的基礎上，它用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基序列的寡核苷酸單鏈(一般為10個bp)作為引物，對所研究的基因組DNA進行單引物擴增。模板DNA經90—94變性解鏈後在較低溫度(36～37℃)下退火，這時形成的單鏈模板會有許多位點與引物互補配對，在72℃下，通過鏈延伸，形成雙鏈結構，完成DNA合成。重複上述過程，即可產生片段大小不等的擴增產物，通過電泳分離和顯色便可得到許多不同的條帶，從中篩選出特徵性條帶。擴增產物片段的多態性反映了基因組DNA的多態性。如果基因組在這些區域內發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合位點的分布發生相應的變化，而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。因此，通過對PCR產物的檢測即可測出基因組DNA在這些區域的多態性。進行RAPD分析時，可用引物的數量很大，雖然對每個引物而言，其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此，RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。
RAPD技術的優點：①不使用同位素，減少了對工作人員健康的危害；②可以在物種沒有任何分子生物學研究的情況下分析其DNA多態性；③對模板DNA的純度要求不高；④技術簡單，無需克隆DNA探針，無需進行分子雜交；⑤靈敏度高，可提供豐富的多態性；⑥RAPD引物沒有嚴格的種屬界限，同一套引物可以套用於任何一種生物的研究，因而具有廣泛性、通用性。
但是，RAPD技術較易受到各種因素的影響。無論是模板的質量和濃度，短的引物序列，PCR的循環次數，基因組DNA的複雜性，技術設備等，都有可能是RAPD技術重複性差的直接原因。目前，多從以下幾個方面來提高反應的穩定性：①操作規範，反應體系的組成要力求一致，儘可能地使RAPD反應標準化；②提高擴增片段的解析度；③將RAPD標記轉化為SCAR標記後再進行常規的PCR分析，可以提高反應的穩定性及可靠性。
2 RAPD技術在魚類、蝦蟹類研究中的套用
2.1在遺傳資源研究中的套用
目前，海產蝦、蟹類遺傳變異的檢測大多通過檢測同工酶的變異來進行，所揭示的同工酶的多態性相對較低。RAPD分析中所需的樣品量極少，其操作程式簡單易行，實驗周期短，因而可以對數量較多的樣品進行分析。利用一套引物可得到不同種屬、品系、群體甚至是個體的大量的RAPD分子標記，並可藉助於計算機進行系統分析，RAPD技術的這些特點使得它可以在蝦、蟹類群體遺傳學、遺傳多樣性分析中發揮重要作用。
RAPD標記可以用來進行蝦、蟹類群體遺傳學研究，檢測種群內、種群間的遺傳多樣性水平，並為種群識別提供可靠的遺傳標記。Garcia等嘗試在斑節對蝦中利用RAPD分析不同地理群體間的遺傳多樣性，並就其在蝦類選育中的套用作了初步探討。Garcia以及A1civar—Warren等在高健康(High Health Shrimp)和無特異病原(Specific—Pathogen—Free，SPF)的南美白對蝦培育中，用RAPD技術對野生種群以及不同的家系進行監測和分析，發現其多態位點的比例為50%左右，其中一個家系的多態位點比例高達77%。劉萍等用RAPD技術對中國對蝦黃渤海沿岸種群親本及子一代的基因組DNA多態性進行了研究，結果證實子代之間的遺傳距離比其父母與子代之間更小，遺傳變異程度更低。邱高峰等用RAPD技術分析了我國近海煙臺、長島等4個地方的20隻中國對蝦的種群內和種群間遺傳差異，結果表明不同地理種群之間存在一定程度的遺傳差異。石拓等，劉萍等、劉振輝等對中國對蝦不同地理種群的遺傳多樣性進行了RAPD分析，結果表明，中國對蝦的遺傳多樣性水平較低。高志乾等對中華絨螯蟹的遼河和長江種群進行RAPD分析，結果顯示，其種內遺傳變異較低，3個種群中，遼河種群和頤江種群遺傳變異較高，而長江種群遺傳變異較低；遼河種群間遺傳距離小於它們與種群間的遺傳距離。甘西等利用RAPD技術對羅氏沼蝦的NY群體和NX群體的遺傳多樣性進行了研究，NY群體的變異明顯小於NX群體。宋林生等及莊志猛等用RAPD技術研究了日本對蝦野生種群和養殖種群的遺傳結構，結果表明，野生種群多態性位點的比例和雜合度明顯高於養殖群體，說明中國沿海的日本對蝦野生種群的種質資源狀況較好，應加以保護。
一個較為詳細的遺傳連鎖圖譜不僅對該物種的遺傳學基礎研究有重要意義，同時對該物種的育種研究也很有幫助。Potlethwait和Stephen等用RAPD技術進行斑馬魚遺傳連鎖圖譜的製作。Liu把RAPD技術套用到鯰魚基因圖譜研究中。孫效文等建立了鯉魚的遺傳連鎖圖譜。圖譜有RAPD分子標記56個，鯉魚的SSLP標記26個，鯽魚的SSLP標記有19個，斑馬魚的SSLP標記有70個，鯉魚基因標記91個，圖譜有50個連鎖組，連鎖圖給出鯉魚的基因組大小在5789cm左右。
2.2確定種、品種間的親緣關係
種群親緣關係的傳統研究方法是從形態學、細胞學、生化指標等方面進行，但受個體和環境的影響較大，有時不能反映物種本身所固有的特徵。物種基因組的組成在RAPD圖譜上得到體現，親緣關係越近，基因組中的同緣序列越多，則以相同引物擴增出的共有標記也就越多。因此，RAPD技術與傳統方法結合是研究物種親緣關係的有效手段。對不同種、同種不同群體的DNA進行RAPD分析，篩選出特徵性條帶，計算相似係數和遺傳距離，從而可確定它們的親緣關係。李思發等用RAPD技術研究中國沿海六水系絨螯蟹(中華絨螯蟹和日本絨螯蟹)群體的親緣關係，從48個引物中篩選出2個具有群體特異性的引物，其中Z2擴增的880bp片段為珠江蟹和南流江蟹兩群體所共有，擴增的700bP片段為長江蟹、黃河蟹、遼河蟹、甌江蟹四群體所特有。這可作為區別中華絨螯蟹(長江蟹、黃河蟹、遼河蟹、甌江蟹)和日本絨螯蟹(珠江蟹、南流江蟹)的分子遺傳標記。用RAPD技術對中國沿海六水系絨螯蟹進行兩大類型劃分與生化遺傳差異分析、形態特徵多元分析的結果一致。宋林生等用RAPD方法研究對蝦屬六個種間的親緣關係，用20個隨機引物擴增，共得到364條清晰穩定的多態性片段，根據擴增片段的共享度計算相對遺傳距離指數，然後用UPGMA和NJ等聚類方法對其進行分析，構建系統樹，確定了它們之間的親緣關係。聚類分析的結果為：中國對蝦、長毛對蝦和墨吉對蝦三者的關係最近，它們首先聚類在一起，然後與斑節對蝦聚在一起，最後是南美白對蝦和日本對蝦。從其結果可以看出，外部形態比較相似的種類在基因組DNA上表現出較大的相似性，反之則較小。宋林生等用RAPD方法研究六種海產蝦類基因組DNA多態性，結果顯示六種蝦的親緣關係與傳統的分類結果基本一致。謝浩等用RAPD方法研究三種絨螯蟹的親緣關係，用一組引物對每種各10個個體的基因組DNA進行擴增，得到一批特異、可重複的擴增圖譜。擴增區帶相似串的分析結果表明，中華絨螯蟹與日本絨螯蟹的親緣關係較遠，而南流江的絨螯蟹(合浦亞種)與日本絨螯蟹較近。
Borrwsky等用隨機引物擴增產物重新構建了脊椎動物DNA指紋圖。Sultman等用DNA標記對麗魚科魚類的系統發育進行了研究。何舜平等運用RAPD的方法對五種鯉科魚類進行了分析，並論述了鮈鯽的系統位置。何舜平等通過對鯉科魚類的隨機擴增，獲得了大量有系統發育信息的DNA多態片段，並繪製了低等鯉科魚類代表屬種的分支系統圖。夏德全等用RAPD方法分析太湖大銀魚、太湖新銀魚和寡齒新銀魚的親緣關係，同時發現有個別樣品的核基因組與太湖中已有的幾種銀魚有顯著差異。鄒曙明等用RAPD方法研究草魚、柏氏鯉和3個地理種群鯉的親緣關係，研究結果支持中國東部魚類具有雙重來源性的觀點。
2.3特定基因的標記
利用DNA分子水平上的變異作為遺傳標記進行基因標記已成為可能。周開亞等用RAPD方法研究鑑別中華絨螯蟹種群，用200個隨機引物對中華絨螯蟹遼河種群、長江種群和甌江種群進行RAPD分析，其中引物HX01和HX02檢測到甌江種群和遼河種群所有樣品共有HX01—0.4和HX02—0.7擴增片段；而長江種群樣品的PCR反應中無這兩個擴增片段出現，因而可作為長江種群的鑑別標記。未發現可區分甌江種群和遼河種群的標記。謝浩等用RAPD方法研究三種絨螯蟹的親緣關係，用引物OPO—05對25箇中華絨螯蟹個體、27個日本絨螯蟹個體及12個日本絨螯蟹合浦亞種個體擴增，發現中華絨螯蟹所有個體都能擴增出一條大小約為1kb的區帶，且相當明顯和穩定，而其它兩種在相同條件下僅有個別個體能擴增出相當微弱的區帶。因此，可將這一區帶作為一個遺傳標記，用於鑑別中華絨螯蟹與日本絨螯蟹及其合浦亞種。
目前RAPD已廣泛套用於鑑別、鑑定不同的生物種類。Johnson用RAPD技術鑑定了不同實驗室品系的斑馬魚。薛國雄對長江、珠江、黑龍江三大水系的草魚產卵場及太湖中捕撈的草魚進行覆蓋性的RAPD分析，結果表明每一水系的草魚種群均有其特徵性基因圖譜，可作為種群鑑定的依據。夏德全等套用該技術檢測了一個奧利亞羅非魚養殖群體和湘湖，美國和沙市三個尼羅羅非魚養殖群體，獲得了鑑別尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚的分子遺傳標記。姚紀花等利用20個隨機引物對產於方正、彭澤和淇河地區的三個銀鯽種群進行了RAPD檢測，也獲得了銀鯽種群鑑定的分子標記。鄧懷等對青魚、草魚、鰱魚、鱅魚、鯽魚、鯉魚、團頭魴、胭脂魚、土鯰和黃顙魚進行了RAPD—PCR擴增。結果顯示RAPD是一種非常靈敏的種間鑑定技術，特別是對魚卵和魚苗的鑑定有重要意義。鄭光明等以池養的鯪、麥鯪為材料，提取血液基因組DNA，利用隨機引物進行PCR擴增，通過縮短擴增時間和電泳時間，快速鑑定了三種不同的鯪魚，並建立了一套DNA分子水平上的快速鑑定魚種的方法。
2.4識別同一物種的性別差異
蝦、蟹的性染色體沒有統一的模式，用常規核型分析方法不能鑑別性染色體。通過RAPD技術可找出同一物種不同性別的基因組DNA特徵性條帶，從而有助於研究性別控制機制，也可為性別確定提供分子依據。邱濤用RAPD技術識別中華絨螯蟹的性別，200個引物中有17個引物擴增出群體水平的差異，其中一個引物(OPM14)擴增出個體水平的差異：雄性有一個800bP的特異帶，而雌性沒有。這可作為有價值的性別鑑別標記。
2.5監測遺傳滲入，維持物種遺傳多樣性
目前，人為的養殖活動、人工放流等使得蝦、蟹類種內不同種群間非自然的遺傳滲入已相當普遍，應引起重視，需加以監測並收集數據，為保護種質資源、維持物種遺傳多樣性提供依據。李思發等用RAPD指紋標記研究中國大陸六水系絨整蟹的親緣關係，引物OPP17擴增的947bP片段的出現頻率，在長江、黃河、遼河三群體中顯著地從南到北遞減，長江蟹87.5%、黃河蟹41.66%、遼河蟹10.83%。這一遺傳滲入的度量可作為區別三水系中華絨螯蟹的判據。邱濤等用RAPD方法研究中華絨螯蟹長江、遼河、甌江水系三群體的遺傳多樣性，並未發現三群體間存在特徵性條帶，但群體間差異大於群體內差異。未發現群體間的分子遺傳標記，但三群體間確實存在差異，表明近來種質資源混雜，遺傳滲入是其中原因之一。
RAPD標記可用於群體遺傳學研究，檢測種群內、種群間的遺傳多樣性水平，並為種群識別提供可靠的遺傳標記。Bardakci等用RAPD技術評估了羅非魚的種群內、種群間的遺傳變異度。Bielawski等進行了太平洋海岸條斑鱸的RAPD分析。Caccone等對歐洲尖吻鱸的DNA多態性進行RAPD—PCR分析。Garcia等嘗試在斑節對蝦中用RAPD分析不同地理群體間的遺傳多態性，並就其在蝦類選育中的套用作了初步探討。王繞梅等用RAPD技術檢測野生鯽魚和四個金魚代表種的基因組DNA多態性。張德春用該技術對湖北、廣西兩個鰱魚人工養殖群體進行了遺傳多樣性的比較研究，為鏈魚人工繁殖的科學規範提供一定的理論依據。張四明等進行了中華鱘隨機擴增多態性DNA及遺傳多樣性研究，結果顯示中華鱘天然群體核DNA水平的遺傳多樣性較低，從而為中華鱘資源的監測和保護提供了理論依據。石拓等用該技術對中國對蝦朝鮮半島西海岸群體的基因組DNA多態性進行了檢測，表明該對蝦群體的遺傳多樣性水平較低。宋林生等對日本對蝦野生群體和養殖群體的遺傳結構的RAPD標記進行了初步的研究，並認為將RAPD以及其他分子標記技術用於海洋動物的育苗育種中，進行標記輔助育種，是海洋動物增養殖健康發展的有力保證。
RAPD技術程式簡單快捷，且無需事先確定目的基因的序列，無種屬特異性，有無數的引物可供利用，能產生足夠的多態性，無需同位索，可以鑑別物種之間和種群之間的基因組的差異，也可區分個體之間的差異。為此，許多從事水產育種工作的科研人員已把RAPD技術套用到水產遺傳育種上，並已取得—定的成果。在海水魚類(如大黃魚等)、海水蝦類的種質資源研究中，由於同工酶所揭示的種內水平上的遺傳差異水平非常低，而RAPD比同工酶更能指示DNA多態性，因此RAPD分子標記在魚類、蝦類、蟹類種質資源遺傳學研究中有著廣泛的套用前景。目前RAPD分析主要套用於標記鑑定、遺傳作圖、系統發育和進化及親緣關係的研究、種群的劃分、群體遺傳多樣性研究等。但在實際套用中，RAPD也表現出不足，如顯陽性位點，在後代中不能區別是純合體還是雜合體；穩定性較差；高度的變異性等缺點。當然有些是可以避免的，解決的方法是對單鏈引物進行篩選，最佳化反應條件，但第一個缺點是無法避免的。如能把RAPD與其它分子標記如RFLP、AFLP和微衛星等結合使用，RAPD仍將會發揮更好的用途。總之，隨著生物技術的不斷發展和更多套用，RAPD技術也將更加完善，套用更加廣泛。
RPAD特點與PCR相比，具有以下幾個特點：①RAPD使用的是隨機引物，不需要預先了解目的的基因和相應的序列。②操作簡便，實驗周期短，能在較短的時間篩選大量樣品。③引物具有普遍適就性，適用於自動化操作分析。
與RFLP相比，具有以下特點：①RAPD分析只需要少量模板，一次擴增僅需20-100ng，這對於DNA量很少的材料進行基因組分析有利。比如對花粉粒、原生質體、種子等的DNA分析是切實可行的。②RAPD標記具有更大的隨機性，亦有利於圖譜的構建。對於DNA含量大的和多倍體物種，RFLP探針會與多倍體的多個片段雜交，所得到的混合指紋會對其它等位基因的闡明帶來困難。而且由於DNA量較大，進行單拷貝的Southern雜交不很實際，至少需要很長的曝光時間，並且已知的探針數量有限。RAPD大大增加了可構建遺傳圖譜物種的數量。③無需藉助於有傷害性的同位素，耗費的人力物力少。④靈敏度高。引物中的個別鹼基的變化會引起擴增條帶和強度的劇烈變化，這是RFLP所無法比擬的。⑤RAPD標記可以覆蓋整個基因組，包括編碼和非編碼區，可以反映整個基因組的變化。⑥RAPD產物有大於50%的條帶擴增於單拷貝區，經過克隆和序列分析後，可作為RFLP和原位雜交的探針，在基因定位、克隆及輔助選擇育種中可以廣泛套用。
RAPD分析的優越性和不足
RAPD是一種全新且有效的遺傳標記，與其他分子標記相比，具有許多優越之處：
①合成一套引物，可用於不同生物基因組的分析。相對來說，RFLP標記具種族特異性，這限制了其套用。
②RAPD技術簡便易行，省力省時。不需要RFLP分析的預備工作，如克隆製備、同位素標記、Southern印跡和分子雜交。並且RAPD檢測靈敏方便，用螢光染料或同位素標記均可檢測，這大大增加了其分析速度。即使用序列膠來分析RAPD，單獨一人僅用36小時便能完成120個樣品的分析，而RFLP至少要花一周時間。
③RAPD分析所需樣品DNA量極少。僅為RFLP的1/1000～1/200，這對於生物早期取樣鑑定或DNA受限制的情況大有益處。
④由於RAPD用於構建基因圖譜時不需要克隆，這可打破克隆載體和宿主的限制，擴大了套用範圍。
⑤每個RAPD標記相當於基因組分析中的靶序列位點，這對共同協作的研究項目，可簡化信息的轉移過程。
⑥RAPD標記可以對那些RFLP難以區分的基因組區域作出遺傳連鎖圖。⑦RAPD分析能自動化，減少了象RFLP那樣的麻煩手續。
然而，RAPD標記也存在某些不足。比如，RAPD標記難以區分開雜合子和純合子基因型，不能有效的鑑別出雜合子。另外，RAPD反應易受外界因素影響，重複性不太令人滿意，等等。因此，使RAPD實驗條件標準化就很重要了。Black（1993）綜述了一些影響條帶的書目、大小和強度的因素，其中包括PCR緩衝液。dNTP和Mg2+濃度、循環參數（退火溫度、變溫時間、PCR儀）、Taq聚合酶來源（Schierwater和Ender，1993）、DNA條件和含量（Black等，1993）。
RAPD技術本身存在的問題及對策
RAPD技術是由多種成分參加的生化反應，反應中各種成分均為微量，儘管其反應靈敏度高，但是影響因素較多，會出現重複性差等一些問題。為了得到較穩定的結果，各種反應參數必須事先最佳化選擇，操作中每一步都必須小心謹慎，以防止出現差錯。
溫度 RAPD一般反應條件是：變性92-95℃，常用94℃，30-60s;延伸72℃，60-120s;退火35-37℃，30-60s。變性和延伸溫度一般沒有太大變化，而退火溫度影響較大。退火溫度低，引物和模板結合特異性較差，出現的條帶可能增多;退火溫度高，引物和模板結合特異性增加。有人提出，在尋找基因差異為目的的實驗中，退火採用33-34℃效果更好。在最佳化方案中，退火溫度可能要提高，以便降低背景，得到少而清晰的"帶"。溫度的梯度率也是十分重要的，特別是退火與延伸之間的梯度尤為重要。各種儀器的控溫、升降溫性能均有差別，一些儀器(如一些舊型號的儀器)在到達特定的溫度前就開始計時，一些PCR儀顯示的溫度與實際溫度會有差異。這些在設計程式和結果分析時有必要考慮，所以註明所用儀器的生產廠家、品牌、規格，就顯得很有必要，對於同一批實驗，注意控制在同樣的溫度條件下進行反應，結果才有可比性。
反應物的影響 PCR擴增受多種成分的制約，產物僅在部分循環中呈指數式(2)增長，逐漸將達到一個平台期，模板是關鍵制約因素之一，RAPD產物取決於此，實驗中非常精確的模板濃度是十分關鍵的一個步驟。濃度過低，分子碰撞機率低，偶然性大，擴增產物不穩定;濃度過高，會增加非專一性擴增產物。更重要的是，若循環數控制不好，引物過早消耗完，後面循環中，PCR擴增產物的3端會和原模板及每一次循環的擴增產物退火，造成不等長度的延伸。因此，如果原模板濃度過高，非專一性擴增產物就足以形成背景，這是高濃度模板造成彌散型產物的原因。相對而言，模板純度影響不大，即反應液中蛋白質、多糖、RNA等大分子物質影響不大。理想的模板和引物濃度能產生多態性豐富、強弱帶分明的RAPD圖譜。引物3端的重要性似乎更大。此外，Mg+2濃度也影響反應的參數包括產物的特異性和引物二聚體的形成，人們在各自的實驗中得出不同的結論，大約在1.5-4mmol/L範圍內。總之，各種反應物的濃度應事先進行篩選最佳化。
污染問題 實驗中應設空白對照，因為引物、各種緩衝液和雙蒸水都會造成污染。而且Taq酶也可能出現污染，給分析帶來困難，所以必須設定對照以排除系統誤差。並且，酶也儘可能最佳化。
擴增條帶的取捨 重複性問題 為了克服RAPD重複性差的問題，應設定重複實驗。作為DNA多態性標記位點的條帶是應該可重複的，重複性好是最重要的取捨指標，而帶的強弱不應該作為取捨的指標。有學者認為帶的強弱與其在基因組中的拷貝數有關。但據Thormann對十字花科植物分析，RAPD產物的強弱與該產物在基因組中的拷貝數無直接關係，而與引物及模板的同源性程度有關。分析一個位點時，要作全面分析，若某一個體的全部帶均弱，其模板可能有問題(濃度、分子量);若某一個體的大部分帶與其它個體強度一致，僅有一條或少數幾條帶弱，可能存在拷貝數差異。重複性不好的弱帶(無規律出現的帶)可能由非專一性擴增、產物間退火或其它人為因素造成，不能記錄。
異源雙鏈問題 Ayliffe研究亞麻鏽病菌時發現F1代中出現的一條帶在親本中沒有出現，進一步研究發現這一條帶是由2個等位基因組成的異源雙鏈形成的，這2個等位基因除中間插入的38bp的序列外，其餘序列相同。在蜜蜂的研究中也發現了相似的問題，這種條帶可以用單鏈核酸酶將其消除。也可以將電泳溫度提高到60℃以上，使異源雙鏈變性，以消除其影響。
非孟德爾遺傳的條帶 Heun等分析認為，在顯示多態性的非模糊條帶中有92.5%的表現為孟德爾顯性遺傳，其餘的條帶不符合孟德爾遺傳，分析認為可能由不同的序列組成。一般實驗中大多採用符合孟德爾遺傳的條帶進行分析。在連鎖圖譜分析中，基因型錯誤可以部分消除，即在F1代或1：1混合物中沒有出現的條帶，在其父母本中應儘可能去掉。
同一條帶的同源性問題 Thormann將RAPD產物標記作探針，雜交結果表明，與探針片斷遷移率一致的帶有時並不同源，這種情況僅發生在種間。並比較了RFLP和RAPD標記在種內和種間得出的結果，發現RFLP和RAPD標記在種內水平的結果完全吻合，但在種以上等級的結果相差甚遠，這說明在電泳結果的同一個帶中，有可能存在序列不同但分子量相同的幾條帶，RAPD無法檢測。這種可能在種內較少發生，而這種間可能性較大，Castagna用RFLP和RAPD比較研究也得出了相同的結論。
電泳解析度問題 電泳時，基因組不同位置的擴增產物共同移動的可能性是有的，即不同分子量的擴增產物可能在電泳時沒有分開而形成一條帶，凝膠分離系統和基因組的親緣關係有可能提高這種機率。一般而言，聚丙烯醯胺和銀染的分辨效果比瓊脂糖和溴化乙銨要高，用較長(可達到20cm)或濃度更高(2%)的瓊脂糖凝膠有助於提高解析度。當然，隨著解析度和靈敏度的提高，更可能出現實驗誤差。所以有人評述：最保險而簡單的方法是用瓊脂糖電脈分離而且只注意那些無疑而重發性高的帶。但是，聚丙烯醯胺和銀染所揭示的高信息量的多態性無疑可加快分子標記的鑑定過程。
顯性標記問題 RAPD標記來自於模板DNA的複製，經過30一40次循環，擴增條帶數量理論上可達2。原模板中擴增位點是純合還是雜合已無法判斷，因為純合位點的擴增條帶只相當於雜合位點的2倍，電泳時無法檢測到其差別。雜交中。如果親本一方為純合體，F1代就可以全部表現出該條帶;如為雜合體，該條帶在F1中應為l：l分離，即一半後代有該條帶，而另一半則沒有。當然來自於多拷貝區的條帶分析更為複雜。
