形成引物二聚體及髮夾結構的能值，在錯配位點的引發效率，引物及產物的GC含量等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。
基本介紹
- 中文名：PCR引物合計
- 原則：引物與模板的序列要緊密互補
- 注意事項：引物的長度一般為15～30bp
- 過程：對引物修飾一般在5'端進行
基本,注意事項,
基本
首先引物與模板的序列要緊密互補；
其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構；
再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配) 。
具體實現這3條基本原則需要考慮到諸多因素,如引物長度，產物長度，序列Tm值，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(用ΔG值反映)，
注意事項
2、引物序列在模板內應當沒有較高相似性片段，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續鹼基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加；
3、 引物3’端的末位鹼基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位鹼基在錯位置導致不同的擴增效率，末尾鹼基為A的錯配效率明顯高於其他三個鹼基，因此應當避免在引物的3'端使用鹼基A；
4、引物序列的GC含量一般為40%~60%，過高或過低都不利於引發反應；
5、上下游引物Tm值相差不超過2℃；
6、對引物修飾一般在5'端進行，5'端序列對PCR的特異性影響不大，但決定產物長度。
