DNA重組

基因組中或基因組間發生遺傳信息的重新組合，被稱為DNA重組（DNA recombination），其中發生在基因組中的DNA重組又稱DNA重排。包括同源重組、特異位點重組和轉座重組等類型，廣泛存在於各類生物。體外通過人工DNA重組可獲得重組體DNA，是基因工程中的關鍵步驟。

基本介紹

• 中文名：DNA重組
• 外文名：DNA recombination
• 類型：同源重組、位點重組和轉座重組
• 作用：是基因工程中的關鍵步驟

意義

①參與DNA複製。

②參與DNA修復。

③參與基因表達調控。

④在真核細胞分裂時促進染色體正確分離。

⑤維持遺傳多樣性。

⑥在胚胎髮育過程巾實現程式性基因重排。

分類

同源重組

同源重組（ homologous recombination）是指發生在兩段同源序列之間的DNA片段交換。兩段同源序列既可以完全相同，也可以存在差異，既可以位於兩個DNA分子上，也可以位於一個DNA分子中。真核生物的同源染色體交換及姐妹染色單體交換、細菌的轉導和轉化、噬菌體的重組都屬於同源重組。有多種模型闡述同源重組機制，這裡介紹其中兩種。

（一）Holliday模型

Holliday於1964年提m Holliday模型，將同源重組分為四個階段。

1．同源序列配對。

2．形成Holliday結構，即兩段同源序列的單股同源DNA的同一磷酸二酯鍵被水解，同源末端交換，連線，形成Holliday結構（HoIJiday structure，又稱Holliday連線體）。

3．形成異源雙鏈DNA，即Hollidav結構發生分支遷移，形成異源雙鏈DNA（hetero-duplex DNA。

4．Holliday結構解離，即兩段同源序列的單股同源DNA的同一磷酸二酯鍵被水解，Holliclay結構解離，連線切口，形成重組體。水解位點不同，所得到的重組體也就不同：

（1）兩次水解的是同股DNA，形成片段重組體（patch recombinant）。這種重組未發生實質性交換，依然是A-B、a-b。

（2）兩次水解的是異股DNA，形成拼接重組體（splice recombinant）。這種重組發生了實質性交換，產物是A-b、a-B。

大腸桿菌Holliday結構的解離由解離酶（resolvase） RuvC催化。RuvC是同二聚體，每個亞基含172AA。

（二）雙股斷裂修復模型

雙股斷裂修復模型（ double-strand break repaii。mnodel）也將同源重組分為四個階段（圖2-32）。

圖2-32

1．同源序列配對。

2．形成3’端突出結構，即配對同源序列之一的DNA雙鏈水解，並由5’外切核酸酶水解，形成3'端突出結構（即3’黏端）（①~②）

3．形成HollidaY結構，即一個3’端攻擊另一段完整的同源序列，隨後發生分支遷移，形成Hollidav結構（③~⑤）。

4．HollidaV結構解離，兩種解離方式得到兩種不同的重組結果。

位點特異重組

位點特異性重組（sile-specific recombinalion）是指發生在特定的DNA序列之間的片段交換，序列之間不要求有同源性。位點特異性重組發生於包括基因表達調控、胚胎髮育過程中的程式性基因重排、免疫球蛋白基因的重排、一些病毒DNA和質粒複製周期中發生的整合與解離等過程中。

（一）重組機制

位點特異性重組本質上是兩個重組位點的四股DNA發生兩次切割和兩次連線的過程，所需的關鍵成分是重組酶（ rccombinase），此外還需要一些蛋白因子。這裡以入噬菌體DNA與大腸桿菌DNA整合而進入溶原狀態為例，介紹位點特異性重組機制（圖2-33）。

圖2-33

1．第一次切割重組酶（又稱入噬菌體整合酶，integrase，356AA，由入噬菌體基因組編碼）四聚體與兩個重組位點（入噬菌體重組位點attP和大腸桿菌重組位點au,B有15bp相同的核心序列）結合，切斷兩個重組位點一股DNA特定的磷酸二酯鍵，形成兩個切口，切口3’端的磷酸基與重組酶活性中心Tyr342的羥基以磷酸酯鍵結合。

2．第一次連線兩個切口的5 7端交換，與對方3’端連線，形成HoUiday結構。

3．第二次切割重組酶切斷兩個重組位點另一股DNA特定的磷酸二酯鍵，形成兩個切口。切口3 7端的磷酸基與重組酶活性中心Tyr342的羥基以磷酸酯鍵結合。

4．第二次連線兩個切口的5’端交換，與對方3’端連線，Holliday結構解離。

有些位點特異性重組體系的兩個重組位點的四股DNA可能同時切割，同時連線，並不形成Holli-day結構。

（二）重組效應

位點特異性重組既可以發生在一個DNA分子中，也可以發生在兩個DNA分子間。重組酶識別位點有方向性，所以重組時兩個重組位點的排列有方向性。

圖2-34

1．插入 當位點特異性重組發生在兩個閉環DNA之間或一個閉環DNA與一個線性DNA之間時，重組的結果是DNA插入（即整合），並且插入之後在兩端形成同向重複序列（DR，圖2-34①從下向上）。

2．缺失 如果DNA分子中一個片段的兩端存在同向重複序列，則該DNA分子可以通過位點特異性重組使該片段缺失，並且缺失片段成環（圖2-34①從上向下）。

3．倒位如果DNA分子中一個片段的兩端存在反向重複序列（1R），則陔DNA分子可以通過位點特異性重組使該片段倒位（圖2-34②）。

轉座重組

1944年，McClintock（1983年諾貝爾生理學或醫學獎獲得者）在研究玉米基因時發現：有些DNA片段可以在染色體DNA中移動位置。現已闡明：基因組DNA巾存在一些非游離的、能自複製或自剪下、並能以相同或不同拷貝在基因組中或基因組間移動位置的功能性片段，被稱為轉座元件（ transposableeleInent）。轉座元件或其拷貝移動位置的現象稱為轉座（ transposition）。大多數DNA轉座對轉座位點的選擇既不要求有同源性，也不要求有特異性，幾乎是隨機的。

轉座元件有很多種類，例如以下兩類：①轉座子（Tn）：最初稱為跳躍基因（ jumping gene），具有完整轉座元件的功能特徵，可攜帶內外源基因組片段（單基因或多基因），可表達出新的表型，由白己編碼的轉座酶（transposase）催化轉座。②逆轉錄轉座子又稱逆轉錄子（ retrotransposon，retroposon）：通過轉錄、逆轉錄進行轉座的轉座元件。這裡介紹轉座子及其轉座。

（一）轉座子

轉座子在原核生物和真核生物中普遍存在，、細菌有兩類典型的轉座子：簡單轉座子和複合轉座子。

1．簡單轉座子（ simple transposon） 又稱插入序列（IS），是結構最簡單的轉座子，長度為700~1531bp，由轉座酶基因序列和兩端長度為9～41bp的反向重複序列構成，其中反向重複序列是轉座酶識別位點（圖2-35）。

圖2-35

2．複合轉座子（ composite transposon） 除了含轉座酶基因序列和反向重複序列之外，還含與轉座功能無關的其他基因序列，這些基因常常賦予宿主細胞某種表型，例如抗性基因賦予宿主細胞抗藥性。複合轉座子可以進一步分類，例如Tn3轉座子就是一種含氨苄青黴素抗性基因的複合轉座子。

（二）轉座機制

細菌轉座子有兩種轉座機制：簡單轉座和複製轉座。

1．簡單轉座（ simple transposilion） 轉座酶將轉座子從原位點切下，插入被轉座酶錯位切割的轉座位點，經過填補之後，兩端形成短的同向重複序列（4~13bp）。原位點或被連線修復，或所屬DNA被降解。降解通常是致死性的（圖2-35）。

圖2-36

2．複製轉座（ replic：ative transposition） 在原位點與轉座位點之間形成共整合體，包括以下步驟：①轉座酶切割轉座子兩端，形成切口。②轉座子的兩個3’．羥基錯位攻擊轉座位點的兩個3’，5’一磷酸二酯鍵。③轉座子與轉座位點共價連線，轉座子複製，形成共整合體（cointegrate，又稱共合體）。④共整合體重組解離，原位點與轉座位點各有一個轉座子（圖2-36）。

（三）轉座效應

DNA轉座可以影響轉座位點基因的功能和活性：①轉座位點位於編碼序列內，轉座子插入導致基因突變。②轉座位點位於調控序列內，轉座子插入影響基因表達。③在轉座位點插入轉座子基因，賦予新表型，例如抗藥性。④鏈內複製轉座後，轉座子拷貝之間發生位點特異性重組，導致缺失或倒位。