鼠尾膠原是一種天然培養基，它具有促進體外培養細胞（特別是上皮細胞）貼壁的作用，同時它也是一種天然的黏附劑，當我們需要在培養瓶或培養皿內放置小玻片，製備細胞爬片時，可在瓶底塗一層膠原，再放上小玻片，自然乾燥後小玻片就固定於培養瓶之中。
基本介紹
- 中文名：鼠尾膠原
- 闡述：一種天然培養基
- 實驗套用：原代培養耳蝸血管紋邊緣細胞
- 類別：相關辭彙
實驗製備,鼠尾I型膠原蛋白,實驗套用,醋酸溶解,真皮類似物的建立,
實驗製備
實驗目的：
鼠尾膠原是一種天然培養基，它具有促進體外培養細胞（特別是上皮細胞）貼壁的作用，同時它也是一種天然的黏附劑，當我們需要在培養瓶或培養皿內放置小玻片，製備細胞爬片時，可在瓶底塗一層膠原，再放上小玻片，自然乾燥後小玻片就固定於培養瓶之中。通過本實驗可掌握鼠尾膠原的製備方法，以及如何切割小玻片，並利用鼠尾膠原將其固定於培養瓶內。
實驗設備及材料：
大鼠尾巴、剪刀、鑷子、止血鉗、彎頭吸管、平皿、三角燒瓶、燒杯、量筒、天平、生理鹽水、75%酒精、0.1%醋酸溶液、蓋玻片、培養瓶、鑽石筆、鼠尾膠原。 實驗內容：
1、製備鼠尾膠原（兩個同學一組操作）。
2、切割小玻片。
3、利用鼠尾膠原將小玻片固定於培養瓶內。
實驗步驟：
製備鼠尾膠原：
1、取大鼠尾巴洗淨，75%酒精浸泡5分鐘；
2、手持尾巴，用止血鉗夾住鼠尾的尖端，折斷尾骨後拉出尾腱；
3、將尾腱剪斷置於平皿中，生理鹽水浸泡；
4、重複步驟2、3，直至尾腱量夠用；
5、吸去生理鹽水，將尾腱稱重（0.5-1克）；
6、將尾腱置於平皿內剪碎，轉移至三角燒瓶中；
7、按每克尾腱50ml的比例，加入0.1%醋酸溶液；
8、搖晃，使尾腱分散於醋酸溶液中，4℃放置一星期；
9、離心，4000轉/分，10-15分鐘；
10、吸取上清，分裝成小瓶，4℃保存。
鼠尾I型膠原蛋白
簡介
鼠尾I型膠原蛋白（Collagenfromrattail,TypeI）系採用Birkedal-Hansen方法在無菌下製備，純度達到95%以上，可溶於0.006mol/L乙酸。本品可用於細胞培養皿的包被，特別適合普通細胞培養器皿不易貼壁細胞的培養；也可用於製備三維膠原凝膠，使細胞在模擬的三維環境中生長。
質量標準
1、SDS-PAGE分析純度大於95%。
2、無菌檢驗結果為陰性。
3、本品2μg/cm2包被細胞培養皿後培養PC-12細胞，貼壁及生長正常。
4、本品濃度1mg/mL，pH7.0時形成具有一定強度的三維膠原凝膠，NIH-3T3細胞在三維凝膠內生長正常、PC-12細胞在三維凝膠表面生長正常。
使用方法
1、細胞培養器皿的表面包被
以包被濃度為2μg/cm2為例，用無菌0.006mol/L乙酸將膠原蛋白稀釋到0.012mg/mL。加到相應的培養器皿中，確保膠原蛋白溶液鋪滿器皿的表面。開蓋在超淨台上過夜晾乾，也可以在室溫放置1小時後，用PBS洗3~4次後直接使用。包被好的器皿在4~25℃至少可保存三個月以上的時間。
2、三維膠原凝膠的製備
A、無細胞三維膠原凝膠的製備（以配製1mg/mL三維膠1mL為例）將200μL本品加到置於冰浴的離心管中，加入690μL雙蒸水，然後加到12μL0.1mol/LNaOH中（如果反過來把12μL0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中，會由於NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結），立即混勻。再加入100μL10×PBS或10×培養液，混勻後立即加到培養器皿中（混勻後pH為7左右，如果PBS或培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要測定pH值）。將培養器皿在室溫放置20min待膠凝固後，轉移到培養箱內。如果配製中使用的是10×PBS，使用前需要加入適當體積的細胞培養液預平衡。
B、含細胞三維膠原凝膠的製備（以配製1mg/mL三維膠1mL為例）準備好懸浮於培養液的細胞，並放置於冰浴中。將200μL本品加到12μL0.1mol/LNaOH中（如果反過來把12μL0.1mol/LNaOH加到膠原溶液中，會由於NaOH不能迅速混勻而產生局部的膠原凝結），立即混勻。再加入23μL10×PBS或10×培養液，混勻後立即加到培養器皿中（混勻後pH為7左右，如果PBS或培養液中沒有加酚紅，初次使用時需要測定pH值）。加入760μL的細胞懸浮液，混勻後立即加到培養器皿中。將培養器皿在室溫放置20min待膠凝固後，加入適當體積的細胞培養液，轉移到培養箱中培養。本品在室溫下pH中性時可迅速成膠，在操作過程中要儘量保持低溫。保存條件4℃保存，切勿凍存，有效期一年。
實驗套用
探討套用鼠尾膠原在豚鼠前庭毛細胞膜片鉗實驗中的促進毛細胞貼壁效果。方法製作鼠尾膠原，觀察全細胞膜片鉗實驗中，自製的鼠尾膠原對前庭毛細胞的貼壁黏附作用。結果無鼠尾膠原時，前庭毛細胞懸浮於外液，不宜封接；有鼠尾膠原時，前庭毛細胞貼附於培養皿底壁，易於封接和長時間（約8h)的觀察和記錄。鼠尾膠原對前庭毛細胞具有良好的貼壁黏附促進作用。結論鼠尾膠原能促進毛細胞貼壁，塗布鼠尾膠原有利於膜片鉗實驗的長時程記錄，並且製作簡便，成本低廉。
鼠尾膠原在原代培養耳蝸血管紋邊緣細胞中的套用。目的：建立利用自製的鼠尾膠原培養大鼠耳蝸邊緣細胞的方法。方法:製作鼠尾膠原,並觀察利用自製的鼠尾膠原所培養出大鼠耳蝸邊緣細胞的效果。結果：自製的鼠尾膠原能正常地培養出大鼠耳蝸邊緣細胞，細胞角蛋白18表達陽性，免疫組織化學結果和掃描電鏡證實所培養的細胞具有典型的分泌上皮細胞特徵。結論：成功建立了利用自製鼠尾膠原培養大鼠耳蝸邊緣細胞的方法，並且製作簡便,成本低廉。
鼠尾膠原為底物的人鼻腔纖毛上皮細胞培養模式的建立目的建立以鼠尾膠原為貼附底物的人鼻腔纖毛上皮細胞的體外培養模式，為人鼻腔黏液纖毛運輸系統的研究提供科學有效的方法.方法製備鼠尾膠原並鋪片，以鼠尾膠原為貼附底物組織塊培養法培養人鼻腔纖毛上皮細胞，培養7天時進行HE染色及掃描電鏡和透射電鏡觀察細胞形態和結構，套用高速攝像技術測量纖毛擺動頻率.結果鼠尾膠原要平坦均勻，平均厚度約為1mm；HE染色可見上皮細胞呈單層向周圍爬開；掃描電鏡下見纖毛上皮細胞呈不規則多角形，纖毛周圍可見微絨毛;透射電鏡下可見纖毛上皮細胞間為緊密連線；同一細胞任意兩點纖毛擺動頻率是相同的；同一來源體外培養的鉤突和下鼻甲的纖毛擺動頻率是相同的.結論以鼠尾膠原為貼附底物人鼻腔纖毛上皮細胞的體外培養模式的成功建立，為今後研究鼻內用藥對纖毛清除功能的影響提供了良好的方法和途徑。
醋酸溶解
1．將鼠尾膠原加入到0.1M的醋酸中，製備成濃度為0.1%的溶液。在室溫中攪拌1-3小時直到完全溶解。
2．建議將溶液轉移到擰口的玻璃瓶中，並小心的在瓶底鋪上一層氯仿。氯仿的量約為膠原溶液的10%。不要晃動或攪拌。在2-8度中放置過夜。在無菌條件下轉移上層的膠原溶液。我們不建議用過濾的方法無菌化。已經發現該方法會導致丟失蛋白。
3．稀釋一定數量的膠原溶液。
4．按照6-10ug/cm2的濃度包被培養瓶。在室溫或37度結合數小時或者2-8度過夜。
5．從包被表面除去多餘的液體。過夜乾燥。如果膠原溶液不是無菌的，這時候可以在無菌細胞操作室中暴光在紫外線下過夜消毒。在接種細胞前用無菌的水漂洗。
真皮類似物的建立
目的：探尋建立真皮類似物的培養方法。
方法：原代培養人皮膚成纖維細胞，製備鼠尾膠原，將鼠尾膠原溶液、濃縮培養基、NaOH溶液和以血清重懸的成纖維細胞溶液在適當的比例下混合後形成凝膠構建真皮類似物。
結果：形成的真皮類似物中成纖維細胞生長狀態良好，並且組織塊具有一定彈性和抗拉伸能力。
結論：①利用鼠尾膠原可以構建真皮類似物，該模型是進行皮膚器官型培養和製作複合皮的關鍵與基礎；②成纖維細胞膠原凝膠複合物有著良好的生物學特性，它是研究成纖維細胞與細胞外基質之間以及細胞之間相互作用的良好模型。
