CMCC(B)63301]的斜面培養物,接種至上述一瓶培養基內,在25℃搖床培養18小時後，取此培養物接種至其餘各瓶培養基內，每瓶接種10ml，同時每瓶加入無菌青黴素4500單位，在25℃搖床培養24小時，再加無菌青黴素2萬單位，繼續培養24小時，再加無菌青黴素2萬單位,繼續培養24小時,離心沉澱菌體，調pH值至約8.5,用濾柱濾過除菌，濾液用無菌操作調pH值至近中性後，分裝於適宜容器內，在10℃以下貯存，備用。
基本介紹
- 中文名：青黴素酶及其活力測定法
- 外文名：Penicillin and its enzyme activity assay
酶溶液的製備,酶活力測定法,
酶溶液的製備
取蠟樣芽孢桿菌[Bacillus
cereus
CMCC(B)63301]的斜面培養物,接種至上述一瓶培養基內,在25℃搖床培養18小時後，取此培養物接種至其餘各瓶培養基內，每瓶接種10ml，同時每瓶加入無菌青黴素4500單位，在25℃搖床培養24小時，再加無菌青黴素2萬單位，繼續培養24小時，再加無菌青黴素2萬單位,繼續培養24小時,離心沉澱菌體，調pH值至約8.5,用濾柱濾過除菌，濾液用無菌操作調pH值至近中性後，分裝於適宜容器內，在10℃以下貯存，備用。
酶活力測定法
青黴素溶液
稱取青黴素鈉（鉀）適量，用磷酸鹽緩衝液(pH7.0)溶解成每1ml中含青黴素1萬單位的溶液。
青黴素酶稀釋液
取青黴素酶溶液，按估計單位用磷酸鹽緩衝液(pH7.0) 稀釋成每1ml中約含青黴素酶8000～12 000單位的溶液，在37℃預熱。
測定法
精密量取青黴素溶液50ml,置100ml量瓶中，預熱至37℃後，精密加入已預熱的青黴素酶稀釋液25ml，迅速混勻，在37℃準確放置1小時，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)[精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸鈉緩衝液(pH4.5)稀釋至刻度]25ml中,在室溫暗處放置15分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L) 滴定，至近終點時，加澱粉指示液，繼續滴定至藍色消失。
空白試驗
取已預熱的青黴素溶液2ml，在37℃放置1小時，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然後精密加青黴素酶稀釋液1ml，在室溫暗處放置15分鐘，用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)滴定。按下式計算：
E=(B－A)×M×F×D×100
式中
E為青黴素酶活力，（單位/ml）/小時；
B為空白滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的容量，ml；
A為樣品滴定所消耗的上述硫代硫酸鈉滴定液的容量，ml；
M為硫代硫酸鈉滴定液的濃度，mol/L；
F為在相同條件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相當於青黴素的單位數；
D為青黴素酶溶液的稀釋倍數。
[附註]
磷酸鹽緩衝液(pH7.0)
取磷酸氫二鉀7.36g與磷酸二氫鉀3.14g,加水使成1000ml。
醋酸鈉緩衝液(pH4.5)
取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml;另取結晶醋酸鈉27.30g,加水使成200ml，兩液混合均勻。
