鋅指核酸酶（ZFNs），ZFNs由一個DNA識別域以及一個DNA剪下域組成。DNA識別域為3～4個ZF串聯結構，每個ZF約含30個胺基酸，被1個鋅離子所固定，可識別並結合1個特異的三聯體鹼基，其二級結構為alpha-beta-beta二級結構，骨架結構保守，其中a-螺旋的-1、-6胺基酸殘基決定鋅指的DNA結合特異性，而這類胺基酸引入序列的改變可以獲得新的DNA結合特異性。DNA剪下域由非特異性核酸內切酶Fok I 羧基端的96個胺基酸殘基組成。每個Fok I 單體與1個ZFP相連構成1個ZFN，並識別特定的位點，當2個識別位點相距恰當的距離時（6～8bp），2個單體ZFN相互作用產生酶切功能，形成雙鏈斷裂，從而介導DNA定點剪下。
基本介紹
中文名：鋅指核糖核酸酶
外文名：ZFN
構成：DNA識別域和非特異性核酸內切酶
目的：增強線蟲的同源重組
化學物質,套用前景,
化學物質
現已公布的從自然界篩選的和人工突變的具有高特異性的鋅指蛋白可以識別所有的GNN和ANN以及部分CNN和TNN三聯體。多個鋅指蛋白可以串聯起來形成一個鋅指蛋白組識別一段特異的鹼基序列，具有很強的特異性和可塑性，很適合用於設計ZFNs。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內切酶來自FokI的C端的96個胺基酸殘基組成的DNA剪下域(Kim et al., 1996)。FokI是來自海床黃桿菌的一種限制性內切酶，只在二聚體狀態時才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構成一個ZFN，識別特定的位點，當兩個識別位點相距恰當的距離時（6~8 bp），兩個單體ZFN相互作用產生酶切功能。從而達到 DNA 定點剪下的目的。
該技術一直以來被Sangamo生物公司所壟斷，該公司只與部分科研機構合作。現在這種形勢得到了改變，一個由八個實驗室組成的協會，在分子生物學家J. Keith Joung的帶領下，提出了製造ZFN的一種開源方式(Maeder et al., 2008)。該組織建立了66個“鋅指”庫，選擇性地針對不同的DNA序列。從庫中建立的“鋅指核酸酶”在測試一個植物基因和三個人類基因時大概有1－50%的高效率，這種效率可以與Sangamo、經典基因立法相媲美。鋅指核糖核酸酶結構示意圖
ZFNs 曾用於增強非洲爪蟾卵細胞、線蟲、果蠅及斑馬魚細胞的同源重組(Bibikova et al., 2001; Morton et al., 2006; Meng et al, 2008; Doyon et al., 2008)。在果蠅中ZFNs介導的同源重組頻率相當可觀，有時大於1%的子代發生了同源重組介導的基因打靶事件(Beumer et al., 2006)。在斑馬魚中，30%-50%的個體將ZFN誘導的突變傳給了子代，而7%~18%的子代為突變型。通過SOLEXA測序發現，在形態正常的胚胎中，脫靶現象僅出現1%。在植物上，Lloyd 等(2005)在擬南芥中用ZFN誘導了染色體基因的定點突變，後代的突變率高達 20%。Voytas的研究小組證明ZFNs可以提高植物基因定點整合和置換頻率。他們在實驗中設計了一個缺失了600bp的靶基因GUS:NPTII,將含有該600 bp的同源DNA片段和ZFNs瞬時表達載體共同轉化菸草原生質體，轉化細胞的10%獲得基因定點置換，比不用ZFNs時效率提高了104~105倍。分子檢測表明20%的重組事件是精確的，沒有伴隨鹼基的缺失或插入(Wright et al.,2005)。這一結果表明利用ZFNs定點切割染色體DNA，可以顯著提高同源重組介導的基因定點整合效率，這為基因定點整合和置換提供了一個非常有潛力的工具。
鋅指核糖核酸酶結構示意圖