重疊延伸PCR技術(genesplicingbyoverlapextensionPCR，簡稱SOEPCR)由於採用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈，從而在隨後的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內切酶消化和連線酶處理，可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物。重疊延伸PCR技術成功的關鍵是重疊互補引物的設計。重疊延伸PCR在基因的定點突變、融合基因的構建、長片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴增等方面有其廣泛而獨特的套用。
基本介紹
- 中文名：重疊延伸PCR
- 外文名：genesplicingbyoverlapextensionPCR
- 簡稱：SOEPCR
- 屬性：技術
以下是重疊延伸PCR的原理及兩基因的引物設計：
A基因：
上游（F1）與開放閱讀框起始密碼子附近的序列相對應，並在5 ’末端添加酶切位點和3個保護鹼基；下游（R1）與A基因終止密碼子附近的序列及B基因5’末端起始密碼子附近的序列互補，並去除A基因的終止密碼子TAA
B基因：
上游（F2）與A基因終止密碼子附近的序列及B基因5 ’端起始密碼子附近的序列相對應，同樣去除A基因終止密碼子TAA；下游（R2）與B基因的開放閱讀框終止密碼子序列互補，並在3’末端添加酶切位點和2個保護鹼基。
先分別用F1、R1，F2、R2擴增出A和B基因，然後再用F1和R2將兩基因連線起來，得到融合基因。
外定點突變技術是研究蛋白質結構和功能之間的複雜關係的有力工具，也是我們在實驗室中改造/最佳化基因常用的手段。而採用重疊引物PCR介導的定點突變實驗是一種快速有效的在基因中特定位點引入特定突變的有效技術。該技術採用具有互補末端的引物，使PCR產物形成了重疊鏈, 從而在隨後的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來。此技術利用PCR技術能夠在體外進行有效的基因重組，而且不需要內切酶消化和連線酶處理，可利用這一技術很快獲得其它依靠限制性內切酶消化的方法難以得到的產物。該技術主要包括以下幾步：設計引物，PCR擴增基因兩端，回收兩端片段，兩端片段退火延伸，擴增全長基因。
1. 引物設計
重疊延伸PCR技術成功的關鍵是重疊互補引物的設計。可以有三種方法來設計引物，具體如下圖所示。
引物F及R為基因兩端特異引物，其中Fm及Rm為中間引物。其中引物Fm及Rm中間共享一段序列（至少10bp完全匹配，否則後續實驗很難成功），突變點可以設計在Fm或Rm，也可以兩條引物上都有突變點。突變點最好是位於引物的5’端，儘量避免出現在3’端。[w1]
2. 分別用引物F和Rm及Fm和R進行配對進行PCR。注意該步一定要用pfu酶，不要用Taq酶，因為Taq酶容易在PCR產物末端加A，從而可能會使產物移碼突變。
3. 分別回收第2步所得兩條PCR產物（一定要用膠回收，準確回收兩條目的條帶）。
5. 取第4步PCR產物做為模板，加入引物F及R進行PCR擴增出具有突變的全基因。
 重疊延伸PCR原理示意圖（時聖晴提供） | 如圖所示，對於整個DNA鏈（可看做由ab、ef和cd片段共同組成），若想通過重疊延伸PCR技術定點敲除掉ef片段，使得ab和cd片段連線起來（將連線後的DNA鏈命名為ad片段），需要分兩步進行PCR（本實驗有個特定要求，ef片段不能是隨機的，因為在下文第二步PCR過程中要求ab和cd片段末端大部分能夠互補才行，不一定要完全互補，因此若要進行重疊延伸PCR，ef片段必須是根據完整序列分析後設計出來的）。第一步PCR：分別利用ab片段的引物F和R2擴增ab片段以及cd片段的引物F2和R擴增cd片段。這樣便分別獲得了ab片段和cd片段。第二步PCR：ab和cd片段既作為模板DNA，其末端又分別作為另一片段的引物（此為設計時要保證二者末端大部分序列可互補的原因），這樣就可以在這一步PCR過程的第一輪循環中合成完整的ad片段。在隨後的循環中利用引物F和R，即可擴增完整的ad片段（時聖晴分析）。 |
