酵母多元培養基

酵母多元培養基是指結合發酵需求、菌種特性、培養基營養需求、產品的發酵代謝途徑、產物合成機制等多個因素來生產培養基。

基本介紹

• 中文名：酵母多元培養基
• 開發背景：與國外還有一點差距
• 套用領域：套用於DHA
• 菌種的特性：亮氨酸和蘇氨酸營養缺陷型菌株

簡介

開發背景

與國外酵母培養基產品相比，國內的一些培養基在某些發酵產品的套用效果上與國外還有一點差距，需要針對這些產品生產的營養需求特徵來開發特定的培養基，提高產品的競爭力。

生物產業的競爭在加劇，高附加值和採用清潔生產工藝生產的新型發酵產品越來越多，傳統的酵母培養基已不能完全滿足行業的發展需求。大部分發酵產品是微生物的初級代謝產物和次級代謝產物，特別是微生物的次級代謝過程複雜，其中培養基的調節作用非常關鍵，有機氮源中的多營養成分對次級代謝的促進作用和反饋抑制作用往往同時存在，所以培養基生產廠家需要加強對發酵代謝調控理論的研究，通過發酵代謝調控理論來分析產物的生成原理，將培養基的生產和產品生產原理緊密的結合起來，使培養基中的各營養成分與發酵產品的生產工藝需求及產物表達原理更匹配。

套用領域

目前，酵母培養基已經被廣泛套用於DHA、長鏈二元酸、透明質酸、酶製劑、鳥苷、肌苷、疫苗等微生物發酵產品的生產中，蛋白質、胺基酸、核酸、維生素、微量金屬元素等營養物質含量均衡合理的酵母培養基能顯著提升發酵產品得率。在一些基因工程菌類產品的生產中，加入酵母培養基後，產品生產更穩定，可顯著的提高產品產量，縮短發酵時間。

從發酵代謝途徑看，大部分發酵產品是經微生物酵解途徑、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環途徑等所產生的初級代謝產物或次級代謝產物，都需要經過嚴格的發酵代謝調控才能提高產品的產量。

發酵產品的生產菌種的特性和發酵代謝途徑

丙酮酸發酵採用的是煙酸、硫胺素、吡哆醇和生物素4種維生素的營養缺陷型菌株。生產時發酵液中的維生素濃度一般控制在：煙酸：8mg/L 硫胺素：0.015mg/L 吡哆醇：0.4mg/L 生物素：0.04mg/L 核黃素：0.1mg/L

賴氨酸的生產菌種為亮氨酸和蘇氨酸營養缺陷型菌株，培養基中的亮氨酸和蘇氨酸需控制在亞適量水平，蘇氨酸濃度一般控制在100-350mg/L，亮氨酸400-600mg/L，同時補充生物素，使發酵液中的生物素>150ug/L。

順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶在PH=2，Cu2+<0.5mg/L，Fe2+<2mg/L時均無活力，同時Mn2+<0.2mg/L，抑制核酸和蛋白的合成，流加NH4+解除ATP和檸檬酸對磷酸果糖激酶的反饋抑制。

通過控制發酵液中金屬離子的含量 ，達到了積累檸檬酸的目的，但同時三羧酸循環的部分中間產物的合成被弱化，導致草醯乙酸的生成量減少，無法進一步生成檸檬酸，所以需要強化丙酮酸合成草醯乙酸的代謝途徑，通過向培養基中補充丙酮酸羧化酶的輔酶（生物素）來強化該代謝途徑。

開發酵母多元培養基的方法和原理

鳥苷、肌苷的發酵採用的是枯草芽孢桿菌的腺嘌呤、黃嘌呤、鳥嘌呤的營養缺陷型生產菌株，通過控制培養基中的腺嘌呤、黃嘌呤、鳥嘌呤的含量，截斷某些非目的產物的合成途徑,截斷目的產物的分解代謝途徑。如圖所示，生產鳥苷時就截斷AMP代謝途徑，生產肌苷時就截斷AMP、XMP、GMP的代謝途徑，從而達到積累鳥苷、肌苷的目的。

鳥苷、肌苷的合成代謝屬於核苷酸的從頭合成途徑，在核酸的合成過程中，天冬氨酸、谷氨醯胺、甘氨酸是肌苷酸、鳥苷酸生產的重要的胺基酸原料，直接決定了肌苷酸、鳥苷酸的產量。谷氨醯胺在酵母培養基中的含量本身就很豐富，因此，可以在培養基中強化谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的含量。利用上述營養缺陷型菌株生產肌苷、鳥苷時，培養基中的腺嘌呤、鳥嘌呤和黃嘌呤應控制在亞適量的水平，在控制非目的產物合成、解除產物的反饋抑制的同時，通過核酸補救合成途徑維持菌體生長。因此較適合的酵母培養基中的核酸應以大分子為主，大分子核酸在菌體生長過程中慢慢被降解，釋放出腺嘌呤、鳥嘌呤和黃嘌呤等小分子類核酸物質，既能維持菌體的生長又能控制產物和副產物的合成代謝。

赤蘚糖合成屬於磷酸戊糖合成途徑，發酵行業中很多產品是通過磷酸戊糖途徑積累發酵產物的，對酵母培養基的營養需求也比較類似。赤蘚糖醇的生產菌種為耐滲透壓酵母，菌體在高滲透壓環境下通過自適應調節，通過積累赤蘚糖來對抗高滲環境，培養基中高濃度的葡萄糖經磷酸戊糖途徑合成赤蘚糖。通過磷酸戊糖途徑合成赤蘚糖醇時，轉酮酶活性的高低很重要，需要高活性的轉酮酶來生成大量的赤蘚糖。轉酮酶的輔酶是TPP，是一種TPP依賴酶，Mg2+是其金屬離子激活劑。赤蘚糖會進一步經莽草酸代謝途徑生成芳香族胺基酸，在赤蘚糖的合成過程中，焦磷酸核糖合成酶和轉酮醇酶活性受芳香族胺基酸和苯丙氨酸等赤蘚糖合成產物的反饋抑制，因此，適合赤蘚糖醇發酵的酵母培養基應該是水解度較低、游離胺基酸較少的培養基，通過控制培養基中芳香族胺基酸的含量，減少其對轉酮酶的反饋抑制。

DHA多採用裂殖壺菌發酵生產，在高碳氮比、高滲透壓條件下菌體通過自適應調節抗滲透壓產脂肪酸。發酵前期，培養基中氮磷含量相對豐富，碳源和氮源被優先利用於菌體生長，脂肪酸產量低。當氮源被逐漸耗盡後，需要進行其他含氮物質的脫氨基、轉氨基等複雜的代謝過程來補充銨根離子，新的蛋白質和核酸的合成因而減速甚至停止，這時脂類的合成開始加速。

氮源相對匱乏時，脫氨酶將部分腺苷酸轉化成肌苷酸和NH3，而產脂微生物線粒體中的NAD+異檸檬酸脫氫酶需要在ADP存在的情況下才具有活性,因此氮源匱乏時，線粒體內檸檬酸和異檸檬酸就開始積累，檸檬酸通過穿膜轉運乙醯CoA,經脂肪酸合成途徑合成DHA。

脂肪酸的合成原料是乙醯CoA和NADPH，乙醯CoA由檸檬酸和ACP醯基蛋白轉運，在乙醯CoA羧化酶作用下完成碳鏈的延長，作為脂肪酸的合成運送工具，其含量的多少直接決定了脂肪酸的生成效率。其活性被鎂離子激活，被琥珀醯輔酶A和長鏈脂肪醯輔酶A抑制，檸檬酸的大量積累和抑制琥珀醯輔酶A的生成的控制可參考之前所講的檸檬酸的生產代謝調控機理。順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶在pH=2,Cu2+ <0.5mg/L,Fe2+ < 2mg/L時均無活力，同時Mn2+<0.2mg/L，抑制核酸和蛋白的合成，流加NH4+解除ATP和檸檬酸對磷酸果糖激酶的反饋抑制。

作為脂肪酸合成的最主要的原料，乙醯CoA是丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的作用下生成的，合成脂肪酸時首先要合成大量丙酮酸，參考之前介紹的丙酮酸的發酵控制原理，DHA生產時，需要強化培養基中的VB1、煙酸、生物素的含量。通過強化培養基中的天冬氨酸和谷氨酸含量，促進核酸和NADPH的合成，增加草醯乙酸的積累，從而增強檸檬酸的積累。同時減少培養基中異亮氨酸、甲硫氨酸和纈氨酸的含量，減少琥珀醯-CoA的含量，減少其對檸檬酸裂解酶的抑制，增強檸檬酸裂解生成乙醯-CoA的能力 ，從而增強脂肪酸的合成能力。

酵母多元培養基的發展方向

我國是一個發酵大國，但大部分發酵產品仍集中在抗生素、維生素等傳統發酵領域，隨著國家逐步實施淘汰落後產能的計畫，隨著人們生活水平的提高，人們對醫藥、食品安全的要求更高，用發酵法生產更安全的、附加值更高的醫藥、食品、保健品等將是大勢所趨。