輔助孵化（assisted hatching） 是利用物理或化學的方法，人為地在胚胎的透明帶上製造一處缺損或裂隙，有利於胚胎從透明帶內“破殼”而出，或使透明帶溶解消失，以達到幫助胚胎孵化促進胚胎植入的目的。增加著床的可能性。
基本介紹
- 中文名：輔助孵化
- 外文名：assisted hatching
- 方法：物理或化學
- 受體：母體
基本信息,原理機理,
基本信息
輔助孵化適用於35歲以上行體外授精-胚胎移植及單精子卵母細胞漿內注射的女性不孕患者。因其卵母細胞透明帶過厚、過硬，利用此項技術可有利於囊胚孵化，提高妊娠率。
透明帶是環繞在卵細胞外的一種非細胞結構，其主要組成為糖蛋白。在結構上透明帶為2層，一層是比較厚而易於穿透的外層，另外一層是比較薄但不易穿透的內層。透明帶在卵子受精至胚胎早期發育這一複雜的過程中起著重要作用。如作為一種物理屏障，保護卵子和胚胎免遭外來有害物的侵襲；在受精過程中通過受體協助精子穿入，同時在精子進入之後通過自身結構的改變，阻礙其他精子進入，從而防止多精子受精引起的異常受精卵；受精後，由於透明帶的存在，使得不斷進行分裂的胚胎保持結構上的完整性。如果人為地去除發育早期胚胎的透明帶，胚胎的發育似乎受影響不大，但存活率明顯降低。正常生理情況下，透明帶在胚胎進行第一次或第二次有絲分裂時開始逐漸變薄，到晚期囊胚期，透明帶已薄到極易被突破的程度。在多種物理的以及生化的因素作用下，晚期囊胚最終突破透明帶，從中完全逸出(這一過程被稱之為孵化)，準備植入子宮內。如果由於某種原因，胚胎不能完成孵化過程，則無法植入子宮內，導致妊娠失敗。在體外受精的臨床實踐中，人們觀察到：經過體外培養後的母體的卵子，在體外受精形成胚胎之後，彈性降低。同時來自於年齡較大的母體的卵子，在體外授精形成胚胎之後，其透明帶硬度較高。這種透明帶硬度改變的現象，可能是造成一部分胚胎在轉移回子宮後，不能成功地植入內膜，導致著床失敗的原因之一。
輔助孵化
輔助孵化原理機理
一、輔助孵化的由來及依據
最早提出輔助孵化概念的是．jacquescohen。他認為：在ivf—et過程中，胚胎不能從透明帶中孵化出來，是造成胚胎植入失敗高的原因之一。如果對體外受精的胚胎進行輔助孵化(即人為地在透明帶上開口，或使其變薄)，將有助於提高胚胎的植入率。
他們的依據是：
①無論是人或者老鼠的胚胎經過輔助孵化的顯微手術後，胚胎開始孵化的時間和孵化的形態學特徵都會發生改變，說明輔助孵化的顯微手術對胚胎的孵化過程確實可造成影響；
②人為地在透明帶上開口之後，胚胎的植入率提高。可能是因為輔助孵化增加了胚胎吻合子宮內膜植入視窗開放的機會；
③透明帶較薄的胚胎易於植入；
④任何影響孵化的因素都會導致胚胎孵化過程的延誤和缺失，致使植入失敗。
1991年cohen的實驗室使用酸化的方法對人類體外培養胚胎成功地進行了輔助孵化。經過輔助孵化之後的胚胎，其植入率雖然有所改善，但與對照組相比，並無統計學上的差異。進一步的觀察和分析表明：輔助孵化並不是對所有的病人和所有的胚胎都有提高植入率的作用，而僅是對於那些因某種原因導致自身孵化困難的胚胎有幫助，如透明帶過厚的胚胎，透明帶異常的胚胎，母體年齡偏大的病人，和fsh水平過高的病人等。由此，產生了選擇性輔助孵化的概念。即根據母體以及每個胚胎自身的具體情況，選擇自身孵化困難的胚胎，給予輔助性孵化。輔助性孵化有助於提高胚胎的植入率，可能是與幫助透明帶厚度和硬度異常的胚胎突破機械性屏障，以及幫助質量差而無足夠能量完成自身孵化的胚胎突破透明帶有關。
二、輔助孵化的特徵由於輔助孵化並不是對每一個胚胎都有提高植入的作用，為了避免使胚胎暴露於不必要的操作程式和刺激，(iohen根據他的實驗室的觀察結果，提出了進行輔助孵化的指征。在以後的ivf實踐中，其他的ivf中心又對這些指征進行了不斷的擴增和補充。雖然不同的ivf中心對指征的掌握有所不同，但總的說來，在決定某個胚胎是否需要進行輔助孵化時，通常考慮的因素包括：母體的年齡、fsh水平、ivf治療史、胚胎自身質量、胚胎自身發育速度、透明帶的厚度、均勻度以及形狀。
1．透明帶
(1)透明帶的厚度：透明帶的厚度大於13um的胚胎應予輔助性孵化；
(2)透明帶的形狀：當胚胎的形狀不規則時，如橢圓形，常常提示透明帶有某種功能上的缺陷。因此，胚胎形狀不規則，通常是需要輔助孵化的指征；
(3)透明帶的顏色：透明帶的顏色偏深，如呈現偏棕色或偏深色，應予以輔助性孵化。
2．母體年齡
母體的年齡是考慮是否需要給予輔助性孵化的一個重要因素。隨著母體年齡的增大，其胚胎的透明帶通常會變厚變硬，失去彈性，造成胚胎自然孵化困難。同時，來自母體年齡較大的胚胎，其質量通常較差，也會給胚胎的自然孵化帶來困難。有的ivf中心以母體年齡38歲為界，凡母體年齡38歲或大於38歲，其所有用於et的胚胎都應給予輔助l生孵化。而有的ivf中心是以母體年齡40歲為界。
3．胚胎的質量
對於質量較差，含有較多碎片的胚胎，其植入的能力通常較差。進行輔助性孵化之後，其植入能力也許有所提高。
4．胚胎的發育速度
發育速度遲緩的胚胎，其自然孵化能力常常減弱，孵化過程常常延遲。輔助性孵化之後，有助於胚胎保持與子宮內膜植入視窗開放時間的一致性。受精後第3d細胞數目仍少於6個的胚胎，經過輔助性孵化後，其植入率高於未經輔助性孵化的對照組。
5．ivf治療史
對於曾有過失敗的ivf治療史的病人，應給予輔助性孵化治療。因為，自然孵化失敗很可能是導致他們ivf治療失敗的原因之一。
6．fsh水平
如果在周期的第3d，fsh水平過高(大於15miu/ml)，通常提示卵巢的功能狀況較差。這類病人的透明帶很可能會因為卵泡發育環境不良而結構異常或功能較差。輔助性孵化常常會提高這類胚胎的植入率。
7．冷凍胚胎
經過冷凍和解凍之後，胚胎的透明帶會變硬。因此，冷凍胚胎是輔助性孵化的指征之一。
三、輔助孵化的方法及其操作目前有4種輔助孵化的方法：機械法、酸化法、雷射法和酶消化法。其中酸化法和機械法在臨床七．套用廣泛，尤其是酸化法；雷射法因為需要特殊的設備，在臨床上較少使用；酶消化法是近年來出現的一種新方法。據報導，酶消化法對囊胚的植入有明顯的幫助，此方法的效果尚待更多的臨床實踐予以證實。
(一)機械法
機械法在英文中稱為pairtialzonadissection，簡稱pzd。
1．輔助孵化工作盤的製作
(1)用含有6%plasmanate(商品化的人類血漿蛋白製劑)的htf或pbs在falcon1006盤中做小滴。根據待輔助孵化的胚胎數目決定小滴的數目。每個小滴的體積中l0入；
(2)在小滴上面覆蓋約4ml左右的經過處理的礦物油(minel·aloil)；
(3)蓋好盤蓋後，將工作盤放人37℃培養箱預熱待用，一般需在使用前30min進行預熱；
2．顯微操作台的準備
將固定針安裝在左手邊的顯微注射針支架上，將pzi)針安裝在右手邊的顯微注射針支架上。
3．機械法輔助孵化的操作
(1)將待輔助孵化的胚胎放人工作盤的小滴中，每滴中放1個，一次以放2個胚胎為宜，以免操作時間長，使胚胎過久地暴露於非培養環境中。
(2)將固定針降入小滴，讓卵黃間隙較大的區域處於11點至l點處，在9點鐘處用固定針將胚胎固定。
(3)將pz[)針降入小滴，從胚胎的1點鐘左右的部位進針，從1l點左右的部位穿出。操作時嚴格避免傷及胚胎的細胞。
(4)將固定胚胎的固定針放鬆，從9點鐘處移至：pzi)針之上，用其反覆磨擦pz[]針．盲至透明帶被穿透，pzd針脫出透明帶，裂隙形成為止。
(5)將胚胎旋轉90度’，重複上述操作2次。最終在透明帶上形成兩條十字交叉的裂隙。
4．將經過輔助孵化的胚胎在乾淨的培養液中清洗3次，然後放回原培養盤的小滴中或者et盤中，等待et
(二)酸化法
酸化法是指使用Acid Tyde's Solution(簡稱AT Solution)溶解透明帶，在透明帶上形成一個直徑約大於20gim的小洞。
1．輔助孵化工作盤的製作
(1)用at溶液在falcon1006盤的上方做一個10九的小滴，用紅色記號筆在盤子底部將其圈起來，以示區別。
(2)用含有6%plasmanate．的htf或pbs在該盤的下部中做體積為10的小滴。小滴的數目等於待輔助孵化的胚胎的數目。
(3)在小滴上覆蓋4ml左右的經過處理的礦物油。
(4)蓋好盤蓋後，將工作盤放入37℃培養箱預熱待用，一般需在使用前30min進行預熱；
2．顯微操作台的準備
(1)將固定針安裝在左手邊的顯微注射針支架上。
(2)將固定針安裝在右手邊的顯微注射針支架上，並與嘴吸控制裝置(moul：h—eontrolledsuc!ion)相連線。
3．酸化輔助孵化的操作
(1)在透明帶上打洞
1)將固定針降人at小滴中，用嘴吸控制裝置將at溶液吸入holdingpipette-，然後將固定針提出液面。
2)用固定針在胚胎的9點鐘處將其固定，並使卵黃間隙較大的區域或者碎片較多的區域處於3點鐘處。
3)將固定針置於胚胎的3點鐘處，使用嘴吸控制裝置小心地將at溶液吹在透明帶上，使其溶解，固定針在吹入at溶液的同時，應做輕微的上下移動，使接觸at溶液的透明帶的範圍約200um。
4)一旦透明帶被溶解穿透，立即停止吹at溶液並迅速小心地開始回吸，以對該區域的at溶液進行清除。
5)繼續用固定針固定胚胎，同時移動顯微鏡的載物台，使胚胎離開剛才的工作區域，減少酸與胚胎的接觸。
(2)取出碎片對於含有碎片的胚胎，可利用剛剛在透明帶上溶解出來的小洞，使用固定針將碎片吸出。進行此項操作時，嚴防傷害胚胎細胞或將胚胎細胞誤吸出來。
4．酸化後胚胎的清洗將經過酸化法輔助孵化的胚胎在乾淨的培養液中清洗3次後，放回原培養盤的小滴中或者et盤中，等待et。
(三)酶消化法
近年來，有的ivf中心為了避免酸溶液對胚胎造成的可能性傷害，用pronast代替at溶液在局部溶解透明帶，以達到輔助孵化的目的。隨著囊胚植人受到越來越多的重視，有的中心採用在植入前將囊胚放入一定濃度的pr)nas溶液中培養24h，使得透明帶完全被酶消化而消失，以促進囊胚的植入。
(四)雷射法
雷射法是指採用雷射光束在透明帶上打洞，以起到輔助孵化的作用。
