超微量分光光度計

超微量分光光度計是一類很重要的分析儀器 ,無論在物理學、化學、生物學、醫學、材料學、環境科學等科學研究領域 ,還是在化工、醫藥、環境檢測、冶金等現代生產與管理部門 ,紫外可見分光光度計都有廣泛而重要的套用。

基本介紹

• 中文名：超微量分光光度計
• 性質：重要的分析儀器
• 常用於：蛋白定量以及細菌生長濃度的定量
• 定量：溶於緩衝液的寡核苷酸

常見的用途

分光光度計是一類很重要的分析儀器 ,無論在物理學、化學、生物學、醫學、材料學、環境科學等科學研究領域 ,還是在化工、醫藥、環境檢測、冶金等現代生產與管理部門 ,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的套用。分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器，常用於核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

超微量分光光度計已成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩衝液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算係數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的係數。如：1OD 的吸光值分別相當於50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述係數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程式，輸入原液和稀釋液的體積，爾後測試空白液和樣品液。然而，實驗並非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。

事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定範圍內變化，即儀器有一定的準確度和精確度。如德國伯赫Colibri超微量分光光度計的準確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩衝液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩衝液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由於樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大於0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此範圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試範圍）。最後是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算係數和樣品濃度單位選擇一致；不能採用視窗磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用於評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純淨的樣品，比值大於1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純淨的核酸A260/A230的比值大於2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

蛋白質直接定量

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白質。由於緩衝液中存在一些雜質，一般要消除320nm 的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大於0.1A，最佳的線性範圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移”。這是一個正常的現象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化範圍不超過1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的係數，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純淨、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對於比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

比色法蛋白質定量

蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：胺基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的胺基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。

比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

Lowry 法：以最早期的Biuret 反應為基礎，並有所改進。蛋白質與Cu2 反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在鹼性溶液里與Cu2 反應產生Cu ，後者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關係極強，反應後形成的化合物非常穩定。相對於Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。

Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對於去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。

某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果並不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由於各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高於Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試後的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以BSA作標準品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標準品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應後1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標準樣品），都必須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑膠的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應後的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。

OD 600

實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要採用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之後定量培養後的含菌培養液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每台儀器用顯微鏡進行細胞計數，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值，原因是採用了顯色的培養基，即細菌培養一段時間後，與培養基反應，發生變色反應。另外，需注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態。

主要結構

各種型號的分光光度計基本結構都相同，由如下五種部分組成：

1)光源(鎢燈、鹵鎢燈，氫弧燈，氘燈、氙燈或雷射光源)；

2)單色器(濾光片、稜鏡、光柵、全息柵)；

3)樣品吸收池；

4)檢測系統(光電池、光電管、光電倍增管)；

5)信號指示系統(檢流計、微安表、數字電壓表、示波器、微處理機顯像管)。

光源-單色器-樣品吸收池-檢測系統-信號指示系統。

區別

與傳統光度計的區別

傳統分光光度計：

1. 樣品體積要求大，絕大部分要50μL以上
   
2. 需使用比色皿
   
3. 每次換樣品時，比色杯需要清洗，工作繁重
   
4. 光程一般為10mm，樣品需要稀釋，測量濃度範圍小
   
5. 燈源一般由氘燈(紫外)和鎢燈(可見)組成，壽命短
   
6. 需要預熱半個小時以上
   
7. 顯示吸光度值，不顯示濃度值
   
8. 儀器體積大，質量重
   

超微量分光光度計

1. 所需樣品體積小，僅需1～2μL
   
2. 不需要比色皿，用移液槍直接將樣品滴加到檢測平台上，測量時樣品自動形成液柱，檢測完成後只需用乾淨的吸水紙將樣品從檢測平台上擦拭乾淨即可
   
3. 具有1mm和0.2mm兩個光程(電機控制自動選擇光程)，樣品無需稀釋，測量範圍可達到常規分光光度計的50倍
   
4. 氙氣閃光燈為燈源，壽命長,性能穩定
   
5. 不需要預熱，可隨時檢測
   
6. 顯示吸光度值的同時，程式直接給出濃度值（核酸、蛋白和螢光染料）
   
7. 體積小：相當於一本字典大小，僅占16.5厘米實驗室空間
   

常見歐美品牌

市場上比較暢銷的超微量分光光度計有：美國ThermoScientific的Nanodrop系列產品,德國伯赫(Berthold)的Colibri，英國Picodrop公司的CUBE和P200系列產品，GE的NanoVue以及其它一些品牌。

賽默飛世爾

品質很是不錯，當然價格不菲。Nanodrop系列是在線上版，需要聯電腦才能操作。在單機版流行的大趨勢下算是一個小小的遺憾。這個品牌優點是產品線寬，ND8000系列可以同時測8個樣本，特別適合高通量實驗室使用。

德國伯赫

伯赫(Berthold)的品牌是科樂比(Colibri)，系統穩定性和檢測準確性重複性也很好，性能品質與Nanodrop相當，同屬於高端產品。不同之處是科樂比是單機版作業系統，彩色觸控螢幕操作。另外，它的樣品台設計避免了樣本蒸發，因此準確性和重複性很是不錯。光電系統很穩定，終生不需校準。

英國Picodrop

Picodrop的P200也是單機版作業系統，與眾不同之處是In-Tip檢測技術，樣品在特製的吸頭內檢測，零交叉污染，樣品100%可回收。唯一的缺點是一次性吸頭有耗材成本。據稱廠家正在實施本地化生產一次性吸頭以降低檢測成本。

英國Biodrop

另一個英國品牌，進入中國稍晚，產品外觀比較漂亮，也是單機版作業系統。