諧波成像

諧波成像是近年發展起來的一種三維光學成像技術 , 具有非線性光學成像所特有的高空間解析度和高成像深度 , 可避免雙光子螢光成像中的螢光漂白效應 , 是一種理想的非侵入生物活體成像方法。生物組織的病變往往會引起微觀結構的變化 , 而二次諧波信號對組織的結構對稱性變化高度敏感 , 因此二次諧波成像對於某些疾病的早期診斷或術後治療監測 , 具有很好的生物醫學套用前景。

基本介紹

• 中文名：諧波成像
• 外文名：harmonic generation
• 專業：三維光學成像技術

背景簡介

背景

1961年紅寶石雷射器發明不久 , Franken等人用紅寶石雷射器輸出波長為 694 nm雷射穿過一個石英晶體時 , 產生 347 nm 的紫外光。這是最早觀察到的光學二次諧波 ( second harmonic generation, SHG) 現象 , 標誌著非線性光學的誕生。 從此 ，SHG被用於倍頻雷射器以得到短波長雷射。近年隨著雷射技術、檢測技術和計算機技術的快速發展， 利用二次諧波進行生物組織的三維成像成為生物醫學成像領域中的熱門課題。引起廣泛關注。

技術簡介

SHG是一個二階非線性過程 , 二次諧波成像具有與雙光子激發螢光 ( two-photon excited fluorescence, TPEF) 顯微成像類似的特性。如 SHG和TPEF的激發效率與激發光的平方成正比 , 因此僅在焦點附近才有足夠的光子能量來激發 , 非線性效應的強局域性減少了成像時非焦點處發光產生的背景干擾 , 提高了信噪比和三維空間解析度； 同時使得非焦平面上的光漂白和光毒性大大降低 , 因此能長時間對樣品進行成像而不影響其活性。 由於二次諧波顯微成像使用近紅外的激發光 , 組織吸收和散射效應最小 , 激發光能深入組織內部 , 相比傳統的顯微鏡 , 如雷射掃描共焦顯微鏡 , 可以做更深層的成像。此外 , 二次諧波成像技術的發射與激發波長相距較遠 , 因此信號易於有效分離。

對活體生物樣品 , SHG還具有一些獨特的優點。SHG一般為非共振過程 , 光子在生物樣品中只發生非線性散射 , 不被吸收 , 因此不產生伴隨的光化學過程 , 可減小對生物樣品的損傷。另外 , 在許多情況下 , 組織的病變過程中的線性光學特性變化很小 , 傳統的線性光學成像技術不能檢測。生物組織發生病變時一般都會伴隨著組織結構、細胞形態及分子結構的變化 , SHG對組織微觀結構變化高度敏感 , 所以有望將該方法用於某些疾病 (如糖尿病、動脈硬化和一些視網膜疾病等 ) 的早期檢測和診斷。 二次諧波顯微成像技術不需進行樣品染色 ,因此對某些不能進行螢光標記的樣品 , 採用二次諧波顯微成像技術檢測有效。

諧波成像原理

介質在強雷射作用下 , 電極化強度與入射輻射的場強E間的關係可表示為

P =ε₀( χ⁽¹⁾E +χ⁽²⁾E²+χ⁽³⁾E³+ …)

其中 , χ⁽¹⁾ 是一階電極化率或線性電極化率 ；χ⁽²⁾ 、χ⁽³⁾ 為二階、三階非線性電極化率張量。 ε₀χ^{( 2)}E² 正是 SHG和 TPEF等二階非線性光學效應的根源。假設入射光的場強為 E₁ cos(ωt + φ) , 由式(1) 可知 , 入射光產生的二階非線性電極化強度為 1/2ε₀χ⁽²⁾E₁²+1/2 ε₀χE₁ cos(ωt +φ) 。其中 , 第二項為二倍頻成分。即在電偶極子近似下 , 非中心對稱分子在頻率為 ω的入射光場作用下 , 輻射光除有線性的頻率成分 ω外 , 還包含了頻率為 0和2ω的非線性成分。當散射介質中分子群產生的以2ω為頻率的非線性散射成分相干 , 就稱為二次諧波產生。

圖1 SHG動量守恆圖解

SHG的一個主要條件是需要沒有反演對稱的介質。當電偶極子近似時 , 在中心對稱的樣品中產生的電極化強度方向相反且大小相等 , 因此相互抵消 , 二階電極化率張量為零 , 即沒有 SHG。

SHG還必須滿足相位匹配條件。如果滿足完全相位匹配條件 , 則傳播中的倍頻光波和不斷產生的倍頻極化波間保持了相位的一致性 , 相互干涉 , 產生的二次諧波振幅由零開始 , 至基波的功率全轉變為二次諧波的功率 , 最終二次諧波的輸出最大。

此外 , SHG還與樣品的非線性光學係數 d_eff 有關 ,d_eff越大越能有效產生二次諧波。 d_eff大的介質 ,滿足相位匹配條件時 , 能有效產生二次諧波.二次諧波的相干性使二次諧波信號的角度分布高度結構化 , 且與激發光的空間分布和介質空間結構密切相關。當介質中散射粒子均勻分布 , 激發光為準直光束時 , 二次諧波的分布為前向。實際上 , SHG現象就是將兩入射光子轉換成一個出射光子 , 其頻率為二次諧波頻率。 為保證軸向的動量守恆 , 當兩倍入射光子動量的二次諧波光子時 , 其方向須與入射光子前進方向一致 。

實驗裝置

SHG實驗裝置按二次諧波信號收集方式可分為前向和後向 , 圖 2為前向和後向二次諧波產生的實驗裝置示意圖。以圖 2 ( a) 為例 ： 由雷射器產生的角頻率為 ω的入射基頻光 , 經過物鏡聚焦到樣品上 , 產生頻率為 2ω的二次諧波 , 由另一個高數值孔徑的物鏡收集 , 濾光片 (一般為窄帶濾光片 ) 濾掉激發光和可能產生的螢光和其他背景光 , 再用探測器件 (如 PMT) 和計算機系統進行信號的採集、存儲、分析和顯示。

圖2 前向後向SHG實驗裝置示意圖

要實現二次諧波顯微成像需要對以下因素進行最最佳化考慮 ： 超短脈衝雷射、高數值孔徑的顯微物鏡、高靈敏度的非解掃面探測器、準相位匹配和具有高二階非線性的樣品。

雷射器

摻 Ti 藍寶石飛秒雷射器因具有高重複頻率 (80 MHz) 和高峰值功率，單脈衝能量低且可在整個近紅外區 ( 700～1 000 nm ) 內連續調諧 , 所以是二次諧波顯微成像的理想光源。雷射的重複頻率對 SHG也有影響 , 如果提高激發光的重複頻率 , 激發光的平均功率可相應提高 , 二次諧波信號也得到增強。

物鏡

一般情況下 , 二次諧波主要非軸向發射 , 即信號收集時必須有一個足夠大的數值孔徑來有效接收整個二次諧波信號。

濾光片

為保證所收集的信號為二次諧波信號 , 必須使用濾光片。一般採用一長波濾光片和窄帶濾光片 (頻寬 10 nm)組合以過濾任何干擾信號。

信號收集系統

為儘量減少二次諧波信號在系統中的損失 , 提高系統的探測靈敏度 , 最好採用非解掃 ( non-descanned) 的信號。信號收集系統中的主要部件是 PMT探測器。首先 , 為收集整個二次諧波信號 , 需要探測器的接收面足夠寬。其次 , 對於由可調諧 Ti 藍寶石飛秒雷射器 , 要接收的二次諧波信號處於 350～500 nm波段 , 故可採用雙鹼陰極光電倍增管。由於激發光波長離探測器的回響區很遠 , 故可有效探測二次諧波信號。除了使用不同的濾光片外 , 二次諧波顯微成像和雙光子激發螢光顯微成像在系統結構上是完全兼容的。 已有人成功地將雷射掃描共聚焦顯微鏡改造成雙光子系統, 同樣 , 也可以方便的用改造後的系統進行兩者的複合成像。

發展及套用

目前 , 對二次諧波顯微成像的套用 , 主要集中在組織或細胞的成像方面 , 特別是對非中心對稱介質 , 如雙折射晶體、有序界面和突變處 (如細胞膜和結構蛋白序列等 ) 的研究。

二次諧波顯微成像與其他成像技術結合

多種成像方法的結合 , 可提供樣品不同側面的信息 , 是目前生物醫學成像領域的研究熱點。 二次諧波顯微成像具有高空間解析度 , 深成像深度 , 低損傷 , 以及對結構對稱性的高度敏感性的特點 , 如果能與其他成像技術結合 , 將成為生物樣品研究的有力工具。

組織生理學中動力學研究

二次諧波顯微是對活細胞、活組織進行成像的一個理想方法。 最近 , 有報導介紹：二次諧波顯微技術運用於組織生理學中動力學研究。 如檢測腫瘤發展狀況, 記錄神經細胞中動作膜電壓改變等。

結論

諧波顯微成像因其對微觀結構的高靈敏度、高空間解析度和對生物的低殺傷性特點 , 為活體測量提供了一種新方法 , 有望成為組織形態學和生理學研究的一個強大工具。目前 , SHG在神經科學、藥理學及疾病早期診斷方面的套用研究已取得一些進展。但二次諧波成像還是一門不很成熟的技術 , 隨著研究的逐步深入 , 對它的套用仍然有待進一步的開發。