誘導性表達載體

表達載體是表達系統的核心，就是在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件（如啟動子、RBS、終止子等），使目的基因能夠表達的載體。為實現外源蛋白分泌表達，最直接的方法就是將該基因插人到宿主分泌蛋白的表達元件（啟動子和分泌信號信號肽序列）的後面。在表達載體中引入嚴格調控的強啟動子，能夠使目的基因在低誘導物濃度條件下仍能表達。誘導方式通常為化學誘導和環境誘導。

基本介紹

• 中文名：誘導性表達載體
• 外文名：Inducible expression vector

表達載體主要有自主複製質粒、整合質粒和噬菌體三種。第一代主要來自金黃色葡萄球菌、革蘭氏陰性菌，通過重組構成帶有雙抗性標誌的嵌合質粒被廣泛套用。第二代質粒載體是穿梭質粒，如大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，可以在大腸桿菌表達系統和枯草芽孢桿菌表達系統中都可以表達外源蛋白。第三代質粒表達載體是嵌合質粒。對於一些外源蛋白的表達，為了提高表達效率，可對表達載體進行改造，就是在克隆載體基本骨架的基礎上增加表達元件，使目的基因能夠表達的載體，在表達載體中引入嚴格調控的強啟動子，通過不同的誘導方式，如環境誘導，化學誘導等，來實現外源蛋白的高效表達。啟動子對外援基因的表達至關重要，它由兩段核甘酸序列構成， 即-35 區的 TTGACA 和-10區的 TATAAT，啟動子控制轉錄的起始位點，並影響轉錄效率。強啟動子還能抑制其它蛋白的表達，從而降低了菌體釋放蛋白酶的可能性， 並有效避免了菌體自溶。啟動子能活化 RNA 聚合酶，使之與模板 DNA 準確的結合併具有轉錄起始的特異性。啟動子是實現外源基因高效表達的關鍵。

常用的誘導型啟動子

優良的分泌能力是枯草芽孢桿菌作為工程菌的一大優勢。 有研究表明，在其菌體生長的對數晚期，會向胞外分泌自身產生的蛋白酶， 這在大程度上影響外源蛋白的積累。 枯草芽孢桿菌的這一缺陷可以通過構建誘導型表達分泌載體來彌。葡萄糖誘導系統和蔗糖誘導系統是枯草芽孢桿菌常用的兩種誘導體系。

誘導性表達載體的誘導方式

誘導型啟動子可根據需要在特定的誘導條件，快速誘導基因轉錄的“開”與“關” 。誘導型啟動子可以分為兩類：一類與環境應答有關，如滲透壓、pH 值、氧氣匱乏、低溫、熱休克等，在這些環境下，啟動子啟動相應基因轉錄，以適應環境變化；另一類是化學誘導啟動子，即受化學誘導物誘導而提高相應基因的表達量。下面主要介紹枯草芽孢桿菌中常用的幾個化學物誘導啟動子。枯草芽孢桿菌中最常見的是受 IPTG 誘導的啟動子，IPTG 能夠與大腸桿菌的轉錄阻遏蛋白 LacI 結合，使得 LacI 從操縱位點上脫離，從而誘導下游基因的表達。最早套用的是啟動子 Pspac，由枯草芽孢桿菌噬菌體 SPO1 和大腸桿菌 lac 操縱子融合而成。枯草芽孢桿菌中第 2 個啟動子系統是以木糖為誘導物的啟動子 Pxyl。Pxyl 由 xylR 編碼的阻遏蛋白嚴格控制表達，通過添加 0.1%-2% 的木糖，能夠誘導該啟動子的表達，木糖啟動子系統對代謝中的大部分代謝產物不敏感，不過卻受到葡萄糖的抑制。枯草芽孢桿菌中第 3 個啟動子系統是以蔗糖為誘導物的 sacB 啟動子，sacB 基因是枯草芽孢桿菌基因組上受蔗糖誘導調控的基因，編碼外分泌的蔗糖果聚糖酶（Levansucrase） 。其啟動子 sacR 轉錄起始是持續性的，不受蔗糖誘導的控制，但在無蔗糖的情況下，其表達強度比有蔗糖誘導時低 100 倍。

誘導性表達載體的類型

葡萄糖誘導系統，蔗糖誘導系統和木糖誘導系統這3 個啟動子誘導系統在枯草芽孢桿菌中套用廣泛，尤其是前兩個系統，常被用做外源蛋白高效表達的元件，但它們共同存在一個缺點就是所用的誘導物 IPTG 和木糖價錢昂貴，在工業生產中易增加成本，因此限制了在工業生產中的套用。而蔗糖誘導啟動子的啟動強度相對較弱，無法在工業生產中高效表達目標蛋白。在食品級乳酸菌中已經形成了一系列適合乳酸菌的基因表達系統，例如：糖誘導表達系統，噬菌體Φ31爆發式誘導的表達系統、乳鏈球菌素調控表達系統、 pH值調控表達系統等。

糖誘導表達系統

乳酸菌基因組中含有糖代謝相關基因簇，在以各種糖類為碳源的培養基上生長。在乳酸菌的糖誘導表達系統中，主要套用的是糖類選擇標記。糖類作為食品級誘導物，可以作為非抗生素抗性的選擇標記進行套用。大多數表達系統使用乳糖作為選擇標記來誘導基因表達。在乳糖選擇系統中，將糖類篩選標記進行克隆，構建食品級載體。

乳鏈球菌素調控表達系統

在乳鏈球菌素調控表達系統中，套用了細菌素抗性選擇標記。細菌素是細菌在代謝過程中產生的一種具有抗菌特性的蛋白質，菌體本身對細菌素具有免疫性。常用的食品級細菌素為乳鏈球菌素，又名乳鏈菌肽（ Nisin），此食品級誘導物控制的基因表達系統為NICE基因表達系統。

pH值調控表達系統

Madsen等通過研究發現了受pH值調節的啟動子P170，構建了表達載體pAMJ529、 pAMJ536和pAMJ547，轉化後發現，當pH值為5.5時，菌株能夠生長，當上調至7.0時表達受到抑制，停止生長。通過調節不同的pH值，進行調控系統的誘導表達。

誘導性表達載體的套用

誘導性表達載體已經成功的套用於酶、多肽、中間代謝物等表達產物的生產，對食品、醫藥、保健業和工業等領域大發展起到極大的推動作用。通過利用強啟動子將克隆基因整合到染色體上，構建高效的誘導性表達載體，通過不同的誘導方法，實現外源蛋白的高效表達。