親環蛋白A促進牛病毒性腹瀉病毒複製的分子機制研究

《親環蛋白A促進牛病毒性腹瀉病毒複製的分子機制研究》是依託吉林大學，由張麗穎擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：親環蛋白A促進牛病毒性腹瀉病毒複製的分子機制研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：張麗穎
• 依託單位：吉林大學

項目摘要

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）引起的一種烈性傳染病。BVDV感染宿主後，病毒大量複製是其治病的直接原因，但其致病機制目前尚不清楚。前期研究發現親環蛋白A（CyPA）特異性抑制劑環孢素A（CsA）和CyPA多抗抑制CyPA的活性後使BVDV複製能力顯著降低。為了闡明CyPA調控BVDV複製的分子機制，本項目擬利用RNA干擾、CRISPR/Cas9 基因敲除和蛋白過表達技術調控CyPA的表達以明確CyPA對BVDV複製的影響；通過pull-down、免疫共沉澱、Western-blot等方法闡明與CyPA互作的病毒蛋白，構建與CyPA互作的BVDV蛋白的截短突變體，鑑定與CyPA互作的病毒蛋白的結構域；通過構建蛋白截短或點突變的CyPA突變體，確定與BVDV蛋白作用的CyPA功能區，從而揭示CyPA促進BVDV複製的分子機制，為研發BVDV新型疫苗和抗病毒藥物提供理論依據。

結題摘要

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV）引起的一種傳染性疾病，其常見的感染宿主為牛、豬、羊、鹿、駱駝和反芻野生動物。牛病毒性腹瀉在臨床上表現為高熱、腹瀉、白細胞減少、免疫抑制、呼吸障礙、急慢性黏膜病等，該病的死亡率為90%～100%。BVDV已被世界動物衛生組織（OIE）列入OIE疾病名錄。目前，該病在世界範圍內頻發，給動物養殖業造成巨大經濟損失，為此，急需疫病控制的理論突破與新的技術支持。病毒是嚴格細胞內寄生的微生物，其完全依賴宿主生命維持系統來完成其生命周期，因此，宿主因子對於病毒複製、蛋白翻譯以及子代病毒的釋放是必不可少的。 本項目利用CyPA的抑制劑CsA和CyPA多抗孵育MDBK細胞後再進行BVDV感染，發現感染細胞能力顯著下降，用BVDV標準株進行同樣的實驗，得到了相似的結果。為了澄清CyPA在 BVDV感染過程中發揮的作用，本研究採用BVDV感染過表達和下調錶達內源性CyPA的細胞系，通過TCID50、Real-time RT-PCR、Western-blot等方法，明確CyPA對病毒早期複製的影響；通過pull-down、核定位、免疫共沉澱、雷射共聚焦、免疫螢光、Western-blot 等方法闡明BVDV的NS5A蛋白與CyPA的互作關係，並通過CyPA蛋白截短的手段找到了CyPA與BVDV NS5A非結構蛋白互作的功能區在126位胺基酸谷氨醯胺上。當該胺基酸突變為亮氨酸時CyPA喪失了與NS5A結合的能力，當用CyPA蛋白對突變的CyPA進行拯救，無法恢復其功能，表明CyPA功能胺基酸的突變是不可逆的。 通過CyPA蛋白與NS5A互作，揭示CyPA在BVDV感染過程中的通過126位的胺基酸與BVDV NS5A蛋白結合發揮起促進BVDV病毒複製的作用機制，為研發BVDV新型疫苗和抗病毒藥物提供分子靶標和理論依據。