螢光原位雜交

螢光原位雜交

螢光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是20世紀80年代末在放射性原位雜交技術基礎上發展起來的一種非放射性分子生物學和細胞遺傳學結合的新技術,是以螢光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。

基本介紹

  • 中文名:螢光原位雜交
  • 外文名:Fluorescence in situ hybridization
  • 簡寫:FISH
  • 工程DNA分子雜交
  • 材料:螢光標記
  • 標誌物:特異寡聚核苷酸片段
  • 目的:檢測該特異微生物種群的存在
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技術發展

螢光原位雜交技術問世於20世紀70年代後期。
1977年,螢光標記的抗體被套用於識別特異性DNA—RNA雜交I I。
1980年,J.G.Baunlan等將套用化學偶聯的方法將螢光素結合到RNA探針上用於直接快速的特異性靶序列檢測。

技術原理

螢光原位雜交技術技術原理是將螢光素直接或間接標記的核酸探針[或生物素、地高辛、dinit rophenyl(I)NP)、aminoacetylAAFfluorine(AAF)等標記的核酸探針與待測樣本中的核酸序列按照鹼基互補配對的原則進行雜交,經洗滌後直接在螢光顯微鏡下觀察。
螢光原位雜交技術是一種重要的非放射性原位雜交技術,原理是利用報告分子(如生物素、地高辛等)標記核酸探針,然後將探針與染色體或DNA纖維切片上的靶DNA雜交,若兩者同源互補,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。此時可利用該報告分子與螢光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應,經螢光檢測體系在鏡下對待DNA進行定性、定量或相對定位分析。

技術優點

與其他原位雜交技術相比,螢光原位雜交具有很多優點,主要體現在:
①FISH不需要放射性同位素標記,更經濟安全。
②FISH的實驗周期短,探針穩定性高,特異性好,定位準確,能迅速得到結果。
③FISH通過多次免疫化學反應,使雜交信號增強,靈敏度提高,其靈敏度與放射性探針相當。
④多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列。
⑤既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化。也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。

技術發展

(一)多彩色螢光原位雜交(multicolor fluorescence in situ hybridization,mFISH)
mFISH是在螢光原位雜交基礎上發展起來的新技術,它不僅具有FISH的優點,而且克服了FISH的許多局限,其最大特點是可將多次繁頊的FISH實驗和多種不同的基因定位在一次FISH實驗中完成。mFISH能同時檢測多個基因,分辨複雜的染色體易位和微小缺失,區分間期細胞多倍體和超二倍體等。mFISH用激發光譜和吸收光譜不同的螢光索按一定調色方法標記不同的探針,從而對不同靶DNA同時進行定位和分析,並能對不同探針在染色體上的位置進行排序。
探針螢光素顏色調配的方法有非調色法,混合調色法和比例調色法。這3種調色法中,比例調色法只需要極少幾種螢光素就可標記多種探針,因而更有發展潛力。染色體描繪(chromosome painting),比較基因組雜交(comparative genomic hybridization,CCH)、光譜染色體自動核型分析(speetral karyolyping.,SKY)、交叉核素色帶分析(cross-species colorbanding,Rx-FISH)和多彩色原位啟動標記(mulicolor primed in situ labeling,mulicolor PRINS)等技術都是在mFISH的基礎,上發展起來的。
(二)DNA纖維螢光原位雜交技術(DNA fiber- FISH)
FISH的解析度取決於載體DNA的濃縮程度,如何提高解析度一直是一個重要課題。Wiegant等和Heng等首先利用化學方法對染色體進行線性化,再以此為載體進行FISH,使其解析度顯著提高,這就是最初的纖維-FISH。纖維-FISH套用各種不同技術,將待研究細胞的全部遺傳物貢即DNA在載玻片上製備出DNA纖維,用不同顏色螢光物質標記的探針與DNA纖維雜交,在螢光顯微鏡下觀察結果並進行分析。
纖維-FISH的關鍵就在於製備高質量的線性DNA纖維。理想製備出的DNA長度應與完全自然伸展的DNA纖維相近,並且.斷裂點應儘可能少。近年來已發展了多種製備DNA纖維的方法。纖維-FISH能進行定量分析,所需模板量少且要求不高,具有解析度高和靈敏度高等優點。因此,纖維-FISH在染色體圖譜繪製,基因重組研究以及臨床染色體基因序列檢測工作中起著十分重要的作用。

技術套用

作為一種可視化特定DNA序列的分子細胞遺傳學技術,螢光原位雜交技術目前被廣泛套用於染色體畸變。如非整倍體、染色體重組。其基本流程包括探針標記、探針的變性、樣本變性、雜交和螢光信號採集。
螢光原位雜交技術在基因定性、定量,整合、表達等方面的研究中頗具優勢,目前已經被廣泛套用於遺傳病診斷、病毒感染分析、產前診斷、腫瘤遺傳學和基因組研究等許多領域,在臨床檢驗、教學和研究等方面扮演著重要的角色。
(一)基因(或DNA片段)染色體定位和基因圖譜繪製
目前套用的基因定位的主要方法是FISH。分離到的DNA序列直接通過FISH,同時採用多種顏色螢光素的標記探針,結合中期染色體和間期細胞方面的信息,可快速確定一-系列DNA序列之間的相互次序和距離,完成基因製圖。用不同顏色炎光索標記2個不同的DNA鏈,而且他們在染色體上的距離大於1Mbp時,可以依據不同探針信號的排列關係分辨他們在染色體上的順序。
若採用5-溴脫氧尿嘧啶( 5-Burd )處理細胞,能夠獲得高分辨顯帶的染色體,提高DNA鏈標記到染色體上的分班能力。如使用間期細胞,2個DNA鏈的距離可以縮短至50kb,這個間距是染色體上分辨距離的1/20,不同探針的次序可以通過測量間期細胞的距離來確定。確定DNA鏈在染色體上的精細位置適用於檢在某些特殊的染色休易位和缺失。標記同一-DNA鏈與不同種屬細胞的染色體雜交,可以找出不同種屬之間的同源基因以及基因在染色體上的位置,從而了解種屬之間的進化關係。
(二)染色體數目與結構異常
在細胞遺傳學檢在中,重複序列的探針套用最多,包括a衛星DNA探針、β衛星DNA探針和經典衛星DNA (elassic- stllite DNA )探針。a衛星DNA探針主要檢測人染色體的著絲粒。β衛星DNA探針位於頂端著絲粒染色體及染色體的異染色質周圍。經典衛星DNA探針有AATCG短片段重複,位於染色體1、9、15、16和Y染色體長臂異染色質周圍。後2種探針除可用於染色體數目檢查外,還可用於上述部位精細改變的檢查。套用FISH技術檢測染色體數目與結構異常,具有較高的特異性及敏感性,目前已被廣泛套用於快速產前診斷。
(三)血液腫瘤學
臨床上對血液腫瘤的FISH檢測主要集中在:染色體異位形成的融合基因的檢測,如ber/abl 易位DNA探針、t( 15; 17)易位DNA探針和t( 18; 21 )易位DNA探針等;基因缺失檢測可以發現一些關鍵基因的缺失,有助於疾病的診斷及預後判斷;使用螢光原位雜交技術可對微小殘留病灶進行檢測,以及進行造血幹細胞移植狀態的監測。
(四)實體腫瘤學
在FISH技術之前的所有測定基因擴增的方法,都是採用經典的分子生物學方法,與FISH相比,這些方法不僅費時費力,而且也不能在細胞水平上觀察到基因擴增的狀態。FISH技術更大的優點是可以在間期細胞核上觀察到DNA擴增的直接證據,而且間期細胞核所顯示出的擴增DNA螢光信號的數量多少及螢光強度常與DNA擴增的水平有關。
FISH被廣泛套用於乳腺癌、膀胱癌,宮頸癌,肺癌和淋巴癌等實體腫瘤的輔助診斷。乳腺癌細胞中Her-2/neu基因的擴增常預示著患者預後較差,25% ~ 30%的乳腺癌患者有Her-2/neu基因的擴增和/或過度表達。套用Her -2/neu基因DNA探針檢測Her-2/neu基因的擴增表達水平,有利於對乳腺癌進行臨床診斷及療效監測。使用染色體著絲粒特異性探針可以對間期細胞進行染色體數量變異分析,如Hopman採用FISH技術研究膀胱癌,發現9號染色體的丟失。採用多種染色體探針,以不同的顏色標記,可用於腫瘤染色體數目改變的異質性研究。目前,FISH主要集中用於對腫瘤的早期診斷、療效檢測,個體化治療和預後判斷等方面。

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