基本介紹
介紹,基本原理,比移值,儀器與材料,操作,薄層板製備,點樣,展開,顯色,套用,優點,
介紹
薄層色譜，或稱薄層層析(thin—layer chromatography)，是以塗布於支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行分離、鑑定和定量的一種層析分離技術。這是一種快速分離諸如脂肪酸、類固醇、胺基酸、核苷酸、生物鹼及其他多種物質的特別有效的層析方法，從50年代發展起來至今，仍被廣泛採用。
基本原理
薄層層析可根據作為固定相的支持物不同，分為薄層吸附層析(吸附劑)、薄層分配層析(纖維素)、薄層離子交換層析(離子交換劑)、薄層凝膠層析(分子篩凝膠)等。一般實驗中套用較多的是以吸附劑為固定相的薄層吸附層析。
吸附是表面的一個重要性質。任何兩個相都可以形成表面，吸附就是其中一個相的物質或溶解於其中的溶質在此表面上的密集現象。在固體與氣體之間、固體與液體之間、吸附液體與氣體之間的表面上，都可能發生吸附現象。
物質分子之所以能在固體表面停留，這是因為固體表面的分子(離子或原子)和固體內部分子所受的吸引力不相等。在固體內部，分子之間相互作用的力是對稱的，其力場互相抵消。而處於固體表面的分子所受的力是不對稱的，向內的一面受到固體內部分子的作用力大，而表面層所受的作用力小，因而氣體或溶質分子在運動中遇到固體表面時受到這種剩餘力的影響，就會被吸引而停留下來。吸附過程是可逆的，被吸附物在一定條件下可以解吸出來。在單位時間內被吸附於吸附劑的某一表面積上的分子和同一單位時間內離開此表面的分子之間可以建立動態平衡，稱為吸附平衡。吸附層析過程就是不斷地產生平衡與不平衡、吸附與解吸的動態平衡過程。
例如用矽膠和氧化鋁作支持劑，其主要原理是吸附力與分配係數的不同，使混合物得以分離。當溶劑沿著吸附劑移動時，帶著樣品中的各組分一起移動，同時發生連續吸附與解吸作用以及反覆分配作用。由於各組分在溶劑中的溶解度不同，以及吸附劑對它們的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列斑點。如作為標準的化合物在層析薄板上一起展開，則可以根據這些已知化合物的Rf值(後面介紹Rf值)對各斑點的組分進行鑑定，同時也可以進一步採用某些方法加以定量。
比移值
Rf=溶質移動的距離/溶液移動的距離。表示物質移動的相對距離。
薄層層析矽膠
薄層層析矽膠各種物質的Rf 隨要分離化合物的結構，濾紙或薄層板的種類、溶劑、溫度等不同而不同，但在條件固定的情況下，Rf對每一種化合物來說是一個特定數值。
儀器與材料
⑴載板
變色矽膠
變色矽膠用以塗布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑膠板，對薄層板的要求是：需要有一定的機械強度及化學惰性，且厚度均勻、表面平整，因此玻璃板是最常用的。載板可以有不同規格，但最大不得超過20×20，玻璃板在使用前必須洗淨、乾燥備用。玻板除另有規定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的規格，要求光滑、平整，洗淨後不附水珠，晾乾。
⑵固定相(吸附劑)或載體
薄層層析矽膠薄層層析矽膠最常用的有矽膠G、矽膠GF〈[254]〉、矽膠H、矽膠HF〈[254]〉，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化鋁、氧化鋁G、微晶纖維素、微晶纖維素F〈[254]〉等。其顆粒大小，一般要求直徑為10～40μm。薄層塗布，一般可分無粘合劑和含粘合劑兩種；前者系將固定相直接塗布於玻璃板上，後者系在固定相中加入一定量的粘合劑，一般常用10～15%煅石膏(CaSO4.2H2O在140℃烘4小時)，混勻後加水適量使用，或用羧甲基纖維素鈉水溶液(0.5～0.7%)適量調成糊狀，均勻塗布於玻璃板上。也有含一定固定相或緩衝液的薄層。
⑶ 塗布器
薄層層析矽膠
薄層層析矽膠應能使固定相或載體在玻璃板上塗成一層符合厚度要求的均勻薄層。
⑷ 點樣器
定性：內徑為0.5mm管口平整的普通毛細管。
定量：微量注射劑。
點樣直徑不超過4mm，點樣距離一般為1~1.5cm即可。
⑸ 展開室
操作
薄層板製備
薄層板除另有規定外，將1份固定相和3份水在研缽中向一方向研磨混合，去除表面的氣泡後，倒入塗布器中，在玻板上平穩地移動塗布器進行塗布(厚度為0.2～0.3mm)，取下塗好薄層的玻板，置水平台上於室溫下晾乾，後在110℃烘30分鐘，即置有乾燥劑的乾燥箱中備用。使用前檢查其均勻度(可通過透射光和反射光檢視)。
手工制板一般分不含粘合劑的軟板和含粘合劑的硬板倆種。
常用吸附劑的基本情況：顆粒的大小，太大洗脫劑流速快分離效果不好，太細溶液流速太慢。一般說來吸附性強的顆粒稍大，吸附性弱的顆粒稍小。氧化鋁一般在100-150目。氧化鋁分為鹼性氧化鋁，適用於碳氫化合物、生物鹼及鹼性化合物的分離，一般適用於PH為9-10的環境。中性氧化鋁適用於醛、酮、醌、酯等PH約為7.5的中性物質的分離。酸性氧化鋁適用於PH4~4.5的酸性有機酸類的分離。氧化鋁、矽膠根據活性分為五個級，一級活性最高，五級最低。
薄層板的活化：矽膠板於105-110℃烘30分鐘，氧化鋁板於150-160℃烘4小時，可得活性的薄層板。
點樣
點樣點樣方式：分為手動點樣和自動點樣。手動點樣主要器具為微量毛細管、微量注射器等。自動點樣採用半自動點樣儀或全自動點樣儀，按預設程式自動點樣。手動點樣靈活方便，常用於各種TCL鑑別中，器具以微量毛細管最常用。儀器的自動點樣準確性好，常用於薄層掃描法的含量測定。
點樣方法：分為接觸式點樣和噴霧點樣。噴霧點樣為儀器控制，在此不展開描述。接觸式手工點樣時，應注意小心用點樣器垂直接觸薄層板表面以防止損傷板面。若薄層吸附劑表面被損壞或點成窪孔，則展開後斑點成不規則形狀；靠近溶劑前沿的化合物形成三角形，靠近原點的化合物形成新月形，影響測定結果。原點損失帶來誤差，也將使展開後的定量和判斷不準確。
點樣應注意的問題：
(1)點樣量：原點位置對樣品容積的負荷量有限，體積不宜太大，一般為 0.5~10μl，樣品的濃度通常為0.5~2mg，太濃時展開劑從原點外圍繞行而不是通過整個原點把它帶動向前，使斑點脫尾或重疊，降低分離效率。點樣量太小，不能檢出清晰的斑點影響判斷。點樣量太多，展開劑不能全部負載，容易產生脫尾現象。當點樣量適合時，可採用點狀點樣；當點樣量過大，原點無法負荷時，可採用條帶狀點樣，得到更好的分離效果，提高解析度。
(2)樣品的溶劑：樣品在溶劑中溶解度很大，原點將變成空心圓，影響隨後的線性展開，所以原則上應選擇對被測成分可以溶解但溶解度不是很大的溶劑。供試液的溶劑在原點殘留會改變展開的選擇性，親水性溶劑殘留在原點吸收大氣中的水分(特別在高濕度環境)對色譜質量也會產生影響，因此除去原點殘存溶劑是必要的，但對遇熱不穩定和易揮發的成分，應避免高溫加熱，以免成分被破壞或損失。
展開
薄層展開展開劑也稱溶劑系統，流動性或洗脫劑，是在平面色譜中用作流動相的液體。展開劑的主要任務是溶解被分離的物質，在吸附劑薄層上轉移被分離物質，使各組分的Rf值在0.2~0.8之間並對被分離物質要有適當的選擇性。作為展開劑的溶劑應滿足以下要求：適當的純度、適當的穩定性、低黏度 、線性分配等溫線、很低或很高的蒸氣壓以及儘可能低的毒性。
展開劑的配製：配製展開劑時，應嚴格控制其比例準確度，如遇到比例很小的溶劑時，應儘量滿足其精確度要求，而不是為圖方便省事直接用滴管加入。展開劑配好後如果渾濁不清，不能立即使用。應轉移入分液漏斗中，待其靜置分層澄清後再取其上層(或下層)液進行展開。
展開劑的用量：展開劑的用量以薄層板放入的深度為距原點5mm為宜，切勿倒入過多，將原點浸入展開劑，成分將被展開劑溶解而不隨展開劑在板上分離。
溶劑蒸氣的作用：溶劑蒸氣在薄層色譜中起著重要作用，它和液相(展開劑)、固定相(吸附劑)一起構成了一個作用機制複雜的三維層析過程。
溶劑的質量：展開劑中溶劑的質量直接影響薄層色譜分離能力。如果含有雜質超標、水分超標以及吸收空氣中干擾氣體等，均可影響分離結果。如甲酸乙酯遇水容易水解，如用多次開瓶的殘存溶劑，因逐漸吸收大氣中的水分而不同程度地分解，所得的色譜與用新鮮溶劑所得色譜有明顯差別。展開劑展開後，溶劑比例發生變化，勿重複使用。
展開方式總的來講平面色譜的展開有線性、環形及向心3種幾何形式。
A 單次展開 用同一種展開劑一個方向展開一次，這種方式在平面色譜中套用最為廣泛。(垂直上行展開，垂直下行展開，一向水平展開，對向水平展開)
C 雙向展開 用於成分較多、性質比較接近的難分離組分的分離。
薄層展開室需預先用展開劑飽和，可在室中加入足夠量的展開劑，並在壁上貼二條與室一樣高、寬的濾紙條，一端浸入展開劑中，密封室頂的蓋，使系統平衡或按正文規定操作。將點好樣品的薄層板放入展開室的展開劑中，浸入展開劑的深度為距薄層板底邊0.5～1.0cm(切勿將樣點浸入展開劑中)，密封室蓋，待展開至規定距離(一般為10～15cm)，取出薄層板，晾乾，按各品種項下的規定檢測。
影響展開的因素
製備離心色譜儀
製備離心色譜儀A 相對濕度的影響
B溶劑蒸汽的影響(a 展開室的飽和b預吸附)
C 溫度的影響
D 展距的影響與分離度僅正比與展距的平方根
顯色
A 光學檢出法
a自然光(400~800nm)
b紫外光(254nm或365nm)
c螢光一些化合物吸收了較短波長的光，在瞬間發射出比照射光波長更長的光，而在紙或薄層上顯出不同顏色的螢光斑點(靈敏度高、專屬性高)
B 蒸汽顯色法
顯色
顯色多數有機化合物吸附碘蒸氣後顯示不同程度的黃褐色斑點，這種反應有可逆及不可逆兩種情況，前者在離開碘蒸氣後，黃褐色斑點逐漸消退，並且不會改變化合物的性質，且靈敏度也很高，故是定位時常用的方法；後者是由於化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強了共軛體系，因此在紫外光下可以發出強烈而穩定的螢光，對定性及定量都非常有利，但是製備薄層時要注意被分離的化合物是否改變了原來的性質。
C 物理顯色法
用紫外照射分離後的紙或薄層後，使化合物產生光加成，光分解、光氧化還原及光異構等光化學反應，導致物質結構發生某些變化，如形成螢光發射功能團。發生螢光增強或淬滅及螢光物質的激發或發射波長發生移動等現象，從而提高了分析的靈敏度和選擇性。
D 試劑顯色法
顯色方法a噴霧顯色：顯色劑溶液以氣溶膠的形式均勻的噴灑在紙和薄層。b 浸漬顯色：揮去展開劑的薄層板，垂直的插入盛有展開劑的浸漬槽中，設定浸板及抽出速度和規定在顯色劑中浸漬的時間。
顯色試劑
a 通用顯色劑硫酸溶液(硫酸：水 1：1，硫酸：乙醇1：1)、0.5%碘的氯仿溶液、中性0.05%高錳酸鉀溶液、鹼性高錳酸鉀溶液(還原性化合物在淡紅色背景上顯黃色斑點)
b 專屬顯色劑
⑸測定比移值
在一定的色譜條件下，特定化合物的Rf值是一個常數，因此有可能根據化合物的Rf值鑑定化合物。
⑹ 薄層掃描
薄層掃描法指用一定波長的光照射在經薄層層析後的層析板上，對具有吸收或能產生螢光的層析斑點進行掃描，用反射法或透射法測定吸收的強度，以檢測層析譜。對於中成藥複方製劑，亦可用相應的原藥材按需要組合作陰、陽對照，然後比較其薄層掃描圖譜加以鑑別。使用儀器為薄層掃瞄器。
如需用薄層掃瞄器對色譜斑點作掃描檢出，或直接在薄層上對色譜斑點作掃描定量，則可用薄層掃描法。薄層掃描的方法，除另有規定外，可根據各種薄層掃瞄器的結構特點及使用說明，結合具體情況，選擇吸收法或螢光法，用雙波長或單波長掃描。由於影響薄層掃描結果的因素很多，故應在保證供試品的斑點在一定濃度範圍內呈線性的情況下，將供試品與對照品在同一塊薄層上展開後掃描，進行比較並計算定量，以減少誤差。各種供試品，只有得到分離度和重現性好的薄層色譜，才能獲得滿意的結果。
套用
食品和營養
食品中的營養成分是蛋白質、胺基酸、糖類、油和脂肪、維生素、食用色素等。與食品和營養有害的物質則有殘留農藥、致癌的黃麴黴素等。這些成分都可用薄層色譜法定性和定量。蛋白質和多肽水解為胺基酸，對不同來源的動物性和植物性蛋白水解後產生不同的胺基酸進行定性和定量，有助於解決蛋白質的結構和食品營養問題。二十多種胺基酸用矽膠G薄層板雙向展開，一次即能分開，然後定性和定量，方法快速而簡便。多糖和寡糖可水解為單糖，可用薄層色譜法進行單糖和雙糖的定性和定量。文獻上有每一個糖的Rf值和相應的展開劑。油和脂肪解為脂肪酸，脂肪酸的種類和結構中的不飽和鍵數，與營養和衛生有關，關於油和脂肪的薄層(矽膠、硅藻土、纖維素)分析，文獻和綜述很多。脂溶性和水溶性維生素在薄層上可方便地定性和定量，例如脂溶性維生素A，D，E，K及B2，B6，B12，酶酸，泛酸，葉酸，C，促生素在矽膠G薄層上可用苯：甲醇：丙酮：冰醋酸(7:2:0.5:0.5)分開。用矽膠G薄層和丙酮：氯仿(1:1)以及激發波長365nm和波長450nm，可用螢光法測定ng量的曲黃素B1,B2,G1,G2，法靈敏快速。
藥物和藥物代謝
薄層色譜法在合成藥物和天然藥物中的套用很廣。有些文獻和內容偏重於合成藥物、化合物及其代謝產物，有文獻為在中草藥分析中的套用。每一類藥物，例如磺胺、巴比妥、苯駢噻嗪、甾體激素、抗菌素、生物鹼、強心甙、黃酮、揮髮油和萜等，都包括幾種或十幾種化學結構和性質非常相似的化合物，可以在上述文獻中找出一、二種全盤的展開劑，一次即能把每一類的多種化合物很好地分開。藥物代謝產物的樣品一般先經預處理後用薄層分析，套用也很廣，但有時因含量甚微，不用採用氣相和高效液相色譜法靈敏。
化學和化工
化工和化學方面的有機原料和產品都可用薄層色譜法分析。例如含各種功能基的有機物，石油產品，塑膠單體，橡膠裂解產物，油漆原料，合成洗滌劑等，內容非常廣泛。
醫學和臨床
薄層色譜法的套用還滲透到醫學和臨床中去，例如它是一種快速的診斷方法可用於妊娠的早期診斷。方法是基於在孕婦的尿中能檢出比未媳婦婦女的尿中含更多的孕二醇，把兩者的尿提取後點在薄層上比較，即可作出判斷。這一方法可不用動物而在2~3小時內化驗出結果。
毒物分析和法醫化學
如前所述，經典的毒物分析有許多缺點，毒物分析和法醫化學採用薄層色譜法等新的手段，對麻醉藥、巴比妥、印度大麻、鴉片生物鹼等均可分析。
農藥
十多種有機磷農藥和六種有機氯農藥都可在矽膠G薄層上分開並測定含量，可用於農藥分析及其殘留量分析。
優點
薄層層析有許多優點：它保持了操作方便、設備簡單、顯色容易等特點，同時展開速率快，一般僅需15～20分鐘；混合物易分離，分辨力一般比以往的紙層析高10～100倍，它既適用於只有0．01μg的樣品分離，又能分離大於500mg的樣品作製備用，而且還可以使用如濃硫酸、濃鹽酸之類的腐蝕性顯色劑。薄層層析的缺點是對生物高分子的分離效果不甚理想。
