基本介紹
- 中文名：腺病毒包裝技術
- 特點：宿主範圍廣
- 滴定濃度：1×1010～1×1012個病毒基因組/ml
- 最終體積：1ml純化後的病毒液（儲存於PBS）
- 原理：同源重組
簡介,技術要點,
簡介
腺病毒（Adenovirus）是目前最高效可靠的重組病毒表達系統之一，可用於在哺乳細胞中瞬時及高水平地表達shRNA或目的蛋白。其具備以下優點：
1. 宿主範圍廣。腺病毒可感染一系列哺乳動物細胞，除可感染幾乎所有人的細胞類型外，還可感染包括大鼠、小鼠、兔、豬、羊、猴、雞等物種。
2. 因腺病毒的感染不依賴細胞周期，故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞。
3. 腺病毒具有嗜上皮細胞特性，因大多數腫瘤細胞均屬於上皮細胞，這使得腺病毒非常適合套用於基因治療領域。
4. 病毒滴度高，可用於動物水平的實驗。
5. 有較好的生物安全性。腺病毒攜帶的基因不會整合到宿主細胞基因組中；實驗中雖然會有一定機率出現RCA（即複製型腺病毒），但由於大多數成人體內都有針對腺病毒的抗體，所以一般危害不大。
技術要點
重組腺病毒的包裝製備：重組腺病毒是從由侵染色斑組成單位（pfu）中分離獲得的。一個單色斑是線性載體質粒轉染後在20×15 cm板上由293A細胞連續侵染後被挑選和擴增形成的。重組腺病毒可通過超速離心純化，並測定滴度及進行PCR鑑定。純化後重組腺病毒的滴定濃度為1010pfu/ml，獲得的量為2-4 ml。
重組腺病毒的特性：一般的，單個腺病毒通常是在30×150mm細胞培養皿中製備的。
獲得量：1×10病毒顆粒/細胞
滴定濃度：1×1010～1×1012個病毒基因組/ml
最終體積：1 ml純化後的病毒液（儲存於PBS）
儲存：批量儲存的最佳條件為-80°C
幾種病毒載體的區別：
腺病毒表達系統 | 慢病毒表達系統 | 逆轉錄病毒 | |
病毒基因組成 | 雙鏈DNA | 單鏈RNA | 單鏈RNA |
載導容量 | < 8 kb | < 8 kb | < 6kb |
基因整合功能 | 無。病毒基因組游離於宿主基因組外，瞬時表達外源基因 | 有。病毒基因組整合於宿主基因組，長時間、穩定表達外源基因 | 有。 |
表達豐度 | 高水平表達 | 中 | 中 |
表達時間 | 快(1-2天) | 慢（2-4天） | 快（1-2天） |
感染細胞類型 | 分裂和不分裂細胞 | 分裂和不分裂細胞。適用於難轉染細胞 | 感染分裂細胞，但在幹細胞中表達效率低 |
滴度TU/ml | 10^12 | 10^9 | 10^9 |
四環素誘導系統 | 不可以 | TET-ON , TET-OFF | 不可以 |
毒性作用 | 細胞毒性 | 遺傳毒性 | 遺傳毒性 |
免疫原性 | 高免疫原性 | 低免疫原性 | 低免疫原性 |
動物模型 | 不能得到轉基因動物 | 可產生轉基因動物，效率達50以上 | 可以，但很難 |
安全係數 | 高 | 高 | 中 |
能否用於MIRCORNA | 可以 | 可以 | 不可以 |
RNAi | 病毒進入細胞往往引起細胞內干擾素反應，不適合做RNAi實驗 | 適合，是RNAi實驗的優選工具 | 可以用作RNAi實驗 |
基因過表達 | 包裝容量較大。可以滿足較大基因的包裝，是過表達基因的優選工具 | 包裝容量有限，過表達的基因過大時，病毒滴度受到影響 | 包裝容量有限，過表達的基因過大時，病毒滴度受到影響 |
常見套用 | 1、體外細胞基因轉導2、基因治療 | 1、體外細胞基因轉導2、基因治療 | 體外細胞基因轉導，突變篩選，功能基因庫構建 |
