物理圖

物理圖

物理圖是指標明一些界標(例如,限制酶的切點、基因等)在DNA上的位置,圖距以物理長度為單位,例如染色體的帶區、核苷酸對數目等。人類基因組計畫的研究目標是,構建人的每條染色體的STS圖,標記之間相距約10Okb。獲得一組組DNA片段的克隆,組內兩兩片段之間有共同的重疊序列;或是獲得標記按正確次序排列、相互毗鄰的片段,其連續長度超過2000kb,以便把染色體分段進行研究。

基本介紹

  • 中文名:物理圖
  • 分類:分子生物學,遺傳學,基因組學
  • 定義:指標明一些界標在DNA上的位置
  • 圖距:以物理長度為單位
構建方法,實驗技術,凝膠電泳,YAC克隆,PCR,原位雜交,細胞分析,

構建方法

最通常的物理圖的構建方法是把限制酶切的DNA片段,按其次序排列連線起來。作圖的技術路線基本上分兩類:一類是由長到短作圖,另一類則是由短到長作圖。前者是將基因組DNA用切點很少的限制酶如NotI等完全酶切,得到長約100~l000kb的DNA長(大)片段,每條染色體平均切成130個片段,按照片段上的標記把片段按次序排列,然後再把每一長片段酶切成短片段,再把短片段排列成序。這是由長到短的作圖,圖比較完整但解析度低。後一類方法則是先將基因組DNA用限制酶作部分酶切,得到的短片段分別用酵母人工染色體(YAC)或粘粒等作載體加以克隆,然後根據克隆片段兩端共有的序列即重疊序列,兩兩連線,逐漸延伸成長片段。這樣作圖解析度較高,但圖不完整往往留有空缺。這是因為有些酶切產生的DNA片段太短,不易被克隆,以致在通過重疊序列把片段連線時出現中斷。一組相互鄰接的DNA片段的克隆稱為鄰接DNA片段組(contig)。目前一個contig通常只有2~6個粘粒克隆,即所含的DNA片段相加只有100~300kb,如除去兩兩片段的重疊序列,則一個contig作圖覆蓋的DNA長度是有限的。現在要求在5年內做到一個contig能覆蓋2000kb DNA,並帶有幾個標記。

實驗技術

凝膠電泳

這是分離高分子量DNA的一種電泳技術,使DNA分子處在兩個相互垂直、交替更換的電場中移動,把分子量不同的DNA片段分開,可分辨50kb至200kb的DNA分子。

YAC克隆

YAC是由質粒pBR322、酵母的著絲粒、四膜蟲rDNA的端粒、酵母的自主複製序列(ARS)以及一些選擇標記基因構成。呈環狀結構時,可以質粒方式在原核細胞中增殖複製。切成線狀結構後,可連同插入的外源DNA,如染色體一樣地在酵母細胞中複製、分配給子細胞。YAC作為載體,克隆的外源DNA平均300kb,最長的可達100Okb,穩定地傳遞給子細胞。設計構建YAC時,在原核生物的複製起點〔Ori)上游安排一個限制酶切位點(如XhoI),當YAC載 有外源DNA後,只需用Xhol酶切,則靠近克隆位點的外源DNA上的XhoI切點,可與YAC的XhoI切點互補結合呈環狀,按質粒進行複製和被回收。這種技術稱為質粒獲救。用這種方法可把外源DNA的末端分離出來,作為釣取與其鄰接的、具有共同末端序列亦即重疊序列的另一DNA片段的探針。實際上這也就是染色體步移的操作。

PCR

PCR(多聚酶鏈反應)體外擴增DNA的技術,在生物學、醫學等基礎研究和臨床診斷上有極其廣泛的用途。在構建基因組物理圖時,主要用於驗證STS。

原位雜交

傳統的以同位素標記探針作原位雜交,曝光後的顆粒較粗,定位不易精確。正在研究以螢光染料代替同位素,提高定位的精確度。

細胞分析

這是利用體細胞遺傳學的方法構建高分辨的染色體圖的技術。人-鼠雜種細胞接受射線輻照後,染色體斷裂,篩選出保留缺失程度不同的人染色體的雜種細胞,可用於構建大尺度染色體物理圖。

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