氯黴素檢測

氯黴素屬廣譜抗生素，曾在畜牧業中廣為套用。但氯黴素有較強的副作用和毒性作用，如果氯黴素在食用動物中殘留，可通過食物鏈傳給人類，長期微量攝入氯黴素，不僅使人體腸道正常菌群失調，而且還會引起多種疾病，對人類的健康造成危害。世界上許多國家禁止此藥用於生產食品動物，並規定了在畜產品中氯黴素不得檢出。

主要方法

氯黴素檢測方法包括微生物法、色譜法、免疫測定法。微生物法易操作，費用低，但靈敏度低，特異性差。色譜法精確可靠、靈敏度高，檢測極限可達到0. 1μgPkg ，但前處理步驟多，回收率偏低 。免疫測定具有靈敏度高、特異性強、對儀器設備和人員素質要求低以及樣品前處理簡單等優點，適於現場監控和大規模樣品篩選。

反應原理

ELISA法：

氯黴素酶聯免疫檢測試劑盒，主要是利用抗原與抗體的特異性免疫化學反應的基本原理來進行的，換句話說，就是利用酶標記物與樣品中的氯黴素與微孔中的抗體進行競爭反應。在整個反應當中，如果樣品中的氯黴素殘留的越多，相對地就會競爭反應越多的酶標記物，使得能結合上抗體的酶標記物相對地減少，用TMB底物顯色，樣品中的氯黴素含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出氯黴素含量。

所需儀器

1.酶標儀(配備450nm濾光片)。

2.旋轉蒸發儀。

3.勻漿器。

4.振盪器。

5.冷凍離心機。

6.微量移液器:單道20μL、50μL、100μL、1000μL；多道250μL。

7.天平:感量0.01g。

8.氮氣吹乾裝置。

試劑材料

以下所有試劑，均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規定的二級水。

1.乙酸乙酯。

2.乙腈。

3.正己烷。

4.0.5N鹽酸溶液

5.0.5N氫氧化鈉溶液

6.氯黴素酶聯免疫試劑盒:2℃～8℃冰櫃中保存。

具體實行

樣品製備

a) 將3克已均質的樣品放入15mL離心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震盪5分鐘。

b) 用離心機離心1700×g10分鐘，取2mL上層液(乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，於50℃下，利用氮氣將有機溶劑吹乾。

c) 在此玻璃管中加入正己烷1mL，先將殘餘物完全溶解後，再加入1mL樣品稀釋液，震盪30秒鐘。

d) 用離心機離心1700×g 10分鐘，利用吸管吸去包含中問乳化層部分的上層液(正己烷)，再吸取下層液(水層)備用。

稀釋倍數:1

若待測物為白蝦可按以下流程將樣品做8倍濃縮以增加檢品敏感度

a) 將6克已均質的樣品放入15mL離心管中，再加入6mL乙酸乙酯，震盪5分鐘。

b) 用離心機離心1700×g 10分鐘，取4mL上層液(乙酸乙酯)至10mL玻璃管中，於50℃下，利用氮氣將有機溶劑吹乾。

c) 在此玻璃管中加入正己烷2mL，先將殘餘物完全溶解後，再加入0.5mL樣品稀釋液，震盪30秒鐘。

d) 用離心機離心1700×g 10分鐘，利用吸管吸去包含中問乳化層部分的上層液(正己烷)，再吸取下層液(水層)備用。

稀釋倍數:0.125

操作步驟

1、於適當微孔中分別加入100mL標準溶液(0，0.05，0.15，0.45，1.35和4.05ppb)。

2、在另外的微孔中加入100mL 已完成前處理的樣品溶液。

3、再於每一微孔中另再加入50mL酶標記物。

4、輕敲盤子四周，使其充分混合後於室溫下避光靜置溫育1小時。

5、將微孔中的反應液甩掉，再將洗液加滿每一微孔後甩掉，重複洗3次。

6、最後一次甩掉後，在吸水紙上拍乾。

7、於每一微孔中加入底物溶液100mL後，輕敲盤子四周，使其充分混合。

8、於室溫下避光靜置溫育20分鐘。

9、於每一微孔中加入100mL反應終止液。

10、用酶標儀于波長450nm下判讀。

判定結果

1. 計算B/B0值。用樣品或標準液吸光度值(B)除以零標準吸光度值(B0)再乘以100%。

2. 以B/B0值為縱坐標，以標樣濃度的對數值為橫坐標，做標準半對數曲線。

3. 根據每個樣品的B/B0值就可從曲線上讀出相對應樣品的濃度。

4. 由於樣品經過了預先稀釋，因此根據標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋倍數。

注意事項

1、使用前先將氯黴素標準溶液6瓶，濃縮萃取稀釋液，濃縮洗滌液，酶標記物，底物溶液及微量測試孔條置於室溫下，回溫30分鐘。

2、原倍萃取稀釋液及洗滌液配製

用蒸餾水將10倍濃縮萃取稀釋液及濃縮洗滌液分別以1： 9的比例稀釋(即1mL濃縮液+9mL蒸餾水)，即可作為樣品萃取稀釋液與微孔板清洗液。

3、回溫後，取出所需微量測試孔條，將剩餘板條立即放回鋁箔袋中用膠帶封好，置於40℃保存。

靈敏度

氯黴素試劑檢測盒的平均檢測下限為 0.05ppb，此濃度之吸光值與陰性標準溶液(0ppb)之吸光值有明顯的差異。

特異性

針對以下抗生素進行交叉反應之測試，結果如下：

Chloramphenicol =100%

Chloramphenicol(free base) <0.1%

Gentamycin <0.1%

Tetracycline <0.1%

Penicillin G <0.1%

Sulfamethazine <0.1%

回收率

生乳(添加1.0ppb)104~117%

蜂蜜(添加0.3ppb)90~110%

蝦及魚肉(添加0.5ppb)95~110%

雞肉(添加0.5ppb) 90~120%

血清(添加0.5ppb)100~120%

內臟(添加1.0ppb) 100~120%

飼料(添加2.0ppb)80~110%

具體產品

氯黴素檢測試劑盒

檢測範圍廣(雞肉、魚、蝦、蟹、牛奶、血清、肌肉、組織、飼料與蜂蜜等)，回收率為80%－120%，靈敏度可達到0.05ppb.

產品規格

包裝：每包96孔

靈敏度: 0.05ppb

測試區間：0.05ppb－4.05ppb

檢測時間：80分鐘(提取後)

儲存條件：2-8℃

氯黴素快速檢測試紙（48條/盒） 型號:DP1

其原理為：在試劑片的 ‘中央判讀區’噴有2條隱形的線，上面一條為對照線(C線)，下面一條為測試線(T線)。若樣品中氯黴素的濃度小於3ppb，則T線呈色與C線相近；若樣品中氯黴素的濃度大於3ppb，則T線將比C線淺很多或完全看不到線，也就是說，氯黴素濃度越高T線越淺。