木質素過氧化物酶

木質素是一類結構複雜、穩定的生物大分子物質。其產量僅次於纖維素。木質素過氧化物酶(LiP)是木質素的生物降解過程中的主要木質素降解酶類。木質素過氧化物酶能夠酶解秸稈、牧草以及飼糧種皮中的木質素，改善飼料原料的飼用品質，從而提高其營養價值。

基本介紹

• 中文名：木質素過氧化物酶
• 外文名： Lignin peroxidase
• 發現時間：1983年
• 酶解類型：氧化酶

簡介

木質素是一類結構複雜、穩定的生物大分子物質。其產量僅次於纖維素。我國秸稈類物質資源豐富，但木質素約占其20%，由於動物體內缺乏降解木質素的酶類，因此其飼料價值較差。研究表明，通過微生物酶的降解作用，可將飼料原料中的木質素分解為可被動物吸收利用的小分子物質，從而提高其飼用價值。木質素過氧化物酶(LiP)是木質素的生物降解過程中的主要木質素降解酶類，可在木素聚合物內形成自由基。導致鍵穩定變差從而破壞木質素大分子。

木質素過氧化物酶的特性與來源

1983年，有人首次從白腐真菌屬的黃孢原毛平革菌的限制性培養基中發現了LiP。並認為其屬於氧化還原酶，是真菌分泌的一種含鐵血紅素的糖基化細胞外蛋白過氧化物酶。研究表明，LiP的糖基化亞鐵血紅素蛋白質通常以多種複合的形式產生，即含有多種同下酶。分子質量一般在37～47 kDa。經過純化後的LiP的分子質量在40 kDa左右，等電點為3.5左右，最適酶活溫度為35～55℃，最適pH為2-5。LiP氧化還原電位為1.5 V，在H₂O₂存在時，LiP能氧化分解芳香環多聚體。被認為是木質素降解的關鍵酶之一。LiP主要是由微生物分泌所產生，如黃孢原毛平革菌、彩絨革蓋菌、變色栓菌、煙管菌、射脈菌、鳳尾菇和朱紅密孔菌等。1989年，有人研究發現，革蘭氏陽性菌T7A也可產生Lip。

木質素過氧化物酶的催化機制及酶活測定

催化機制

LiP是一系列含Fe³⁺、卟啉環和血紅素輔基的同工酶。1988年有研究人員發現，LiP可利用H₂O₂及有機過氧化物催化一系列底物，其催化作用具有非特異性。另外，有研究也發現LiP的作用底物很廣泛。主要包括酚類和非酚類芳香化合物，可以氧化木質素單體、二體、三體以及多環芳烴(如苯並芘)等底物。其降解底物的特點為：LiP能氧化富含電子的酚型或非酚型芳香化合物。在通過電子傳遞體攻擊底物時，能從苯酚或非酚類的苯環上奪取一個電子，將其氧化成自由基，繼而以鏈式反應產生許多不同的自由基。導致底物分子中主要鍵斷裂，然後發生一系列的裂解反應。

酶活測定

LiP酶活的測定主要採用黎蘆醇氧化速率法。由於黎蘆醇是LiP作用的直接底物，根據310 nm處測得的黎蘆醇的吸光度值大小來判定LiP的酶活。具體方法為：1 mL反應液中含0.2 mL藜蘆醇溶液、0.4 mL酒石酸緩衝液(250 mmoL/L，pH 3.0)、0.4 mL培養液或稀釋液、20μL 20mmoL/LH₂0₂溶液，於30℃反應2 min，測定310 nm的吸光度值。在空白組中，以蒸餾水代替H₂0₂溶液，其他反應物不變。1個酶活單位(U)的定義為每分鐘氧化黎蘆醇產生1 μmol黎蘆醛所需的酶量。

木質素過氧化物酶的生產

游離培養木質素過氧化物酶

游離培養LiP合成的主要影響因素為培養基的成分和培養條件(氧濃度)。2005年張紅等在限碳靜置、限氮振盪不加藜蘆醇的環境下，研究發酵條件對黃孢原毛平革菌合成LiP影響的結果顯示：限碳靜置培養時，酶活可達1193 U/L。碳源以葡萄糖0.04%和糊精0.16%同時存在比單一葡萄糖作為碳源獲得較高的酶活；限氮振盪培養時，所得酶活可達980 U/L。2003年畢鑫等在靜置和振盪兩種培養條件下研究營養條件對白腐菌合成LiP影響的結果表明：靜置培養時，LiP在碳氮比低的培養基中顯示較高的酶活力，碳源以葡萄糖0.02%和糊精0.18%同時存在或分段加人要比單一葡萄糖作為碳源時獲得更高的酶活；振盪培養時，在碳氮比高的培養基中LiP酶活最高。而類似於靜置培養的氮源組合及分段模式卻明顯抑制LiP的合成；最佳化後，靜置培養在第6天可獲得7560 U/L的酶活，振盪培養在第8天獲得6500 U/L的酶活。2000年柯世省等研究發現，氧濃度對固定化黃孢原毛平革菌合成過氧化物酶影響較大，空氣環境下限碳培養黃孢原毛平革菌，其合成的LiP最高活力可達360 U/L。比通純氧條件下限碳培養時高160%。

固定化培養木質素過氧化物酶

近年來，採用固定化細胞培養合成LiP已得到了廣泛的重視，與游離細胞培養相比，其能更有效地合成LiP。目前已採用多種載體對黃孢原毛平革菌的固定，其中用尼龍網、矽管、聚丙烯、不鏽鋼、瓊脂糖和瓊膠顆粒等均取得了較好的效果。固定化後的菌絲穩定性增強並且可以重複利用。2008年吳葉明等用大孔吸附樹脂進行黃孢原毛平革菌來源的LiP固定化試驗的結果表明，在樹脂1.0 g、酶液pH 4.5、加酶量87.2 U、吸附溫度25℃、吸附4 h、0.2%戊二醛、處理120 min條件下，可獲得最佳的固定化效果，固定化酶活可達到16 U/g。2009年劉東華等通過共價結合法將LiP固定於聚氨酯泡沫上，發現固定化酶活為1.45 U/g(泡沫乾重)，酶活回收率達到34.79%，提高了固定化LiP的熱穩定性。且擴大了固定化LiP穩定性的pH範圍，且其重複利用性好。

利用反應器生產木質素過氧化物酶

目前，有很多關於利用生物反應器生產LiP的報導。由於LiP胞外生產的特點要求，因此除了必須滿足菌體需要的營養限制(限碳或限氮)、足夠的供氧等環境條件外，還應避免其胞外酶的結構及活性遭受剪下力等因素的破壞。與游離和固定化培養相比，生物反應器有以下幾個特點：能夠控制內部流體混和均勻、剪下力適宜：為了給細胞生長和目標產物酶的合成提供最佳的環境條件。需要能夠對反應器中的pH、溫度、溶解氧、氧化還原勢、攪拌轉速等參數進行測量和控制：必須防止雜菌污染，維持純種培養等。所以利用生物反應器本身的結構和運行參數對其產酶至關重要。

目前主要使用以下幾種生物反應器來生產LiP。2002年，Couto等在機械攪拌式反應器中實現了固體培養，LiP酶活均值高達246.8 U/L。2001年Dominguez等採用轉鼓式生物反應器半浸沒培養黃孢原毛平革菌，LiP的酶活達364 U/L。2003年張朝暉等在三相鼓泡塔反應器中培養黃孢原毛平革菌，在通氣量為1.0 L/(L·min)時，LiP酶活最高達367 U/L。2003年，Ruggeri和Sassi利用滴流床生物反應器間歇培養黃孢原毛平革菌，LiP酶活達1220 U/L。2002年，Shim和Kawamoto把生長培養基和誘導培養基交替通入到8 L的固定床反應器中間歇培養合成LiP。其最高酶活為1800 U/L。而1997年，Gerin等比較了由氣體攪動的氣升式反應器、鼓泡式反應器和有螺旋槳攪動的攪拌式反應器後發現，使用氣升式反應器LiP酶活的最大值達4500 U/L。綜合上述研究可以發現，使用氣升式反應器能夠獲得更高的LiP的酶活。

木質素過氧化物酶的套用

在畜牧生產中

2002年，趙紅霞等利用白腐真菌降解秸稈中的木質素和纖維素，使其成為含有酶的糖類。提高了秸稈的適口性，易於消化吸收。2005年，Celeux和Lavergne利用白腐真菌的菌絲分泌的超纖維氧化酶可溶解秸稈表面的蠟質，菌絲進入秸稈內部並產生纖維素酶、半纖維素酶、內切聚糖酶、外切糖酶，從而可降解木質素和纖維素。其中機制可能為LiP和錳過氧化物酶(MnP)在分子氧的參與下，依靠自身形成的H₂O₂觸發啟動一系列自由基鏈反應，實現對木質素無特異性的徹底氧化，使秸稈降解成為含有酶的單糖，從而提高了秸稈的消化性。2008年，賈燕南等研究表明LiP和MnP可降解四環素．且在酶活為40 U/L時，LiP比MnP的降解能力強；對於LiP，當其酶活從15 U幾升高至40 U/L時。四環素降解率提高約15%。當酶活進一步升高至70 U/L時，降解率變化不大。

其他

LiP在降解有機污染物、生物製漿、處理污染廢水等方面還有廣泛的套用。2002年，張朝暉等研究表明，黃孢原毛平革菌所產的LiP能氧化多種多氯酚類物質，有些酚類物質常常是廣譜生物殺蟲劑或除草劑的前體。1996年，林鹿等報導，在LiP單獨使用或與其他酶的適當配合處理紙漿，使得製得的紙張具有良好的抗張強度和平滑度，這不僅提高紙張白度而且還降低了紙張的卡伯值。2003年，Gary等研究發現LiP可以處理2，4一二溴苯酚等工業廢水，在氧化的過程中形成二聚體、三聚體和四聚體，從而消除了廢水的毒性。