斑點雜交

斑點雜交是指將待測的DNA變性後點加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜、NC膜）上，用已標記的探針進行雜交，洗膜（除去未接合的探針），放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交強度，主要用於基因缺失或拷貝數改變的檢測。

基本介紹

• 中文名：斑點雜交
• 外文名：Dot blot
• 雜交方法：先將膜在水中浸濕，再放到15×S
• 作用：基因缺失或拷貝數改變的檢測

方法介紹

斑點雜交（Dot blot）是將被檢標本點到膜上，烘烤固定。這種方法耗時短，可做半定量分析。一張膜上可同時檢測多個樣品，為使點樣準確方便，市售有多種多管吸印儀（Manifold），如MinifoldⅠ和Ⅱ、Smart Blotter(Wealtec)、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot，它們有許多孔，樣品加到孔中，在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀。反覆沖洗進樣孔，取出膜烤乾或紫外線照射以固定標本，這時的膜就可以進行雜交。

斑點雜交儀

DNA斑點雜交方法

①先將膜在水中浸濕，再放到15×SSC中。

②將DNA樣品溶於水或TE，煮沸5min，冰中速冷。

③用鉛筆在濾膜上標好位置，將DNA點樣於膜上，每個樣品一般點5μl(2~10μg DNA)。

④將膜烘乾，密封保存備用。

RNA斑點雜交方法

與上法類似，每個樣品至多加10μg總RNA（經酚/氯仿或異硫氰酸胍提取純化），方法是將RNA溶於5μl 焦碳酸二乙酯（DEPC）水，加5μl 甲醛/SSC緩衝液（10×SSC中含6.15mol/L甲醛），使RNA變性，然後取5-8μl點樣於處理好的濾膜上，烘乾。

完整細胞斑點雜交方法

套用類似檢測細菌菌落的方法，可以對細胞培養物的特異序列進行快速檢測，將整個細胞點到膜上，經NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規方法進行雜交與檢測。有人曾用此法從10個培養細胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細胞斑點印跡法可以用於篩選大量標本，因為它使細胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標記的探針雜交，但它不適用於非放射性標記探針，因為DNA純度不夠，會產生高本底。