該實驗方法是針對從特定細胞或組織類型的mRNA池來源的樣品用PCR技術對其中許多的cDNA基因一起進行擴增和顯示的實驗方法。該實驗方法倚賴兩套不同類型的合成寡核苷酸引物：一套錨定反義引物與一套隨機正義引物。
基本介紹
- 中文名：差異顯示法
- 概述 ：該實驗方法是針對從
- 原理：錨定反義引物是與m
- 方法：[最佳化DNA濃度：cDNA第一鏈
原理,方法,
原理
錨定反義引物是與mRNA的poly(A)尾及3’-非翻譯區的連線處相復性結合。正義引物是一種10-mer的隨機引物，將錨定引物與隨機引物加入反應混合液，用PCR技術進行雙鏈cDNA產物的擴增。通過比較兩種不同細胞類型或在不同生長條件下同種細胞類型來源的擴增cDNA產物的電泳帶譜，能夠用於鑑定其表達基因圖譜的差異。
方法
[最佳化DNA濃度：cDNA第一鏈的製備]
1．用幾支0.5 ml離心管，設立實驗反應管系列，建立對照管和實驗管的RNA最佳濃度。用水對RNA樣品進行5倍連續稀釋系列，產生RNA樣品濃度範圍在1μl/ml與100μg/ml之間系列。
2．從錨定3’-寡核苷酸引物庫中選擇一個或更多的引物，設立不同的稀釋RNA模板量的復性反應系列：RNA模板 8.0μl，錨定3’-寡核苷酸引物2.0μl。反應管在65℃水浴上溫育10 min，然後放置在37℃水浴上。
3．加入復性反應試劑：
5×DD-PCR反轉錄緩衝液 4μl
100 mmol/L DDT 2μl
200μmol/L 4種dNTP混合液 2μl
約25單位/μl Rnase抑制劑 0.25μl
200單位/μl反轉錄酶20μl
H2O補足至20μl
反應管溫育樣品管在37℃反應1 h。
4．將反應管內樣品在94℃加熱10 min，使反轉錄酶失活。
[最佳化RNA濃度：雙鏈cDNA的擴增與製備]
5．用8隻0.5 ml擴增管設立兩個實驗系列。每隻管應該包含如下試劑：
10×擴增緩衝液 2μl
錨定3’-寡核苷酸引物 2μl
20 mmol/L 4種dNTP混合液（pH 8.0） 1μl
[α-32P] dNTP或[α-32S]dNTP（3000 Ci/mmol） 1μl
5單位/μl熱穩定DNA聚合酶1單位
H2O 9μl
對於每支反應管加入2μl 5’隨機引物，輕彈管壁使反應液混勻。
6．從含有測試RNA與對照管RNA的反轉錄的兩個系列的8支試管中各取3μl樣品，蓋上試管，輕輕混勻樣品。
7．如果PCR儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層加一滴礦物油（約50μl）。放置離心管在PCR儀上。
8．擴增反應有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度列表如下：
循環數
變性
復性
聚合
30個循環
94℃ 15s
42℃ 30s
72℃ 15s
末輪循環
94℃ 15s
42℃ 30s
72℃ 2min
9．擴增反應程式運行結束後，從PCR儀取出反應管，每支反應管各加入5μl 5×測序膠上樣緩衝液。
10． 套用DNA序列分析型的電解質梯度聚丙烯醯胺凝膠電泳分離這种放射標記擴增物，電泳在穩定電源作用下進行，到二甲苯腈藍電泳至凝膠長度的三分之二處結束。抽乾凝膠，將凝膠放置在放射自顯影底片的下部壓片。
11． 檢查對照與試驗RNA的不同濃度來源的擴增反應產物的DNA條帶譜型。一種理想的差異顯示的條帶譜型最好能清晰地分辯100～250條電泳譜帶。DNA模板的最佳量對於不同的樣品、不同的引物也是個不相同的。選擇對照與試驗RNA的最適濃度，使得在該濃度下引物配對引導擴增得到最大量的DNA產物。
[用於差異顯示的擴增cDNA的製備]
12． 套用所有的引物組合與RNA模板最佳量，重新復性，反轉錄和擴增反應。設計在PCR儀上用96孔板即微量滴定板設立所有的反應循環。
13． 套用聚丙烯醯胺測序膠電泳分離擴增反應產物，如步驟9和10。用每對引物所獲得的擴增反應樣品上樣在測序凝膠上的毗鄰的泳道上，比如套用配對引物A+B從一種RNA樣品所獲得的擴增樣品與同一對引物A+B從另一種RNA樣品所獲得的另一個擴增產物在凝膠泳道上相鄰。用這種方法對於樣品編排序號後大大簡化了對於放射自顯影帶譜的比較研究。
14． 從不同的RNA樣品中每一對引物所獲得的擴增產物的帶譜的比較研究。
[差異顯示的cDNA的回收與重擴增]
15． 從抽乾的聚丙烯醯胺凝膠上回收目的條帶。防止放射自顯影X線片在凝膠的上方，對於放射自顯影X線片上的目的條帶的位置用軟鉛筆輕劃標記。用乾淨剃鬚刀刀刃沿鉛筆標記將上層的放射自顯影膠片與下層的凝膠一併切割，切下每一條目的的條帶，將目的條帶的凝膠條貼放在Whatman 3MM紙上；將每一薄片的抽乾凝膠紙片放入一隻0.5 ml的離心管（內有50μl滅菌水）。
16． 用小的針穿刺每一隻浸泡過液的0.5ml的離心管的底部；把每一隻穿刺管放入一隻1.5 ml離心管中，離心20 s後將洗脫液轉移至另一隻更大的離心管中，丟棄擴增管中殘餘的凝膠條和Whatmen 3MM紙條。
17． 用已洗脫液中的DNA片段作模板，在擴增反應管中一次加入試劑：
10×擴增緩衝液 2μl
聚丙烯醯胺凝膠中洗脫的DNA樣品 3μl
5’-隨機寡核苷酸引物2μl
3’-錨定寡核苷酸引物 2μl
20 mmol/L 4種dNTP混合液（pH 7.0） 1μl
5單位/μl Taq熱穩定DNA聚合酶 2單位
H2O 9.5μl
18． 如果PCR儀沒有配置加熱蓋，在反應混合液的上層應加一滴礦物油（約50μl）。放置離心管在PCR儀上。
19． 擴增反應有變性、復性和聚合（延伸反應）；相應的循環條件與溫度如下表：
循環數
變性
復性
聚合
30個循環
94℃ 15s
42℃ 30s
72℃ 15s
末輪循環
94℃ 15s
42℃ 30s
72℃ 2min
20． 抽取每種重擴增樣品的5%～10%，用1%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳來估計出重擴增DNA片段的含量。
21． 若用礦物油覆蓋在微量離心管內樣品液體的上層（步驟18），反應結束後可用150μl氯仿抽提去除。
22． 將重擴增DNA片段連入一種帶有dT尾的載體，取部分連線液轉化大腸桿菌宿主菌。
23． 從培養平皿上挑取6個或更多個轉化菌落，抽提其質粒DNA，套用相應的限制性內切核酸酶進行酶切鑑定，通過比較插入片段的大小確定重組轉化子。
24． 套用儘可能多的途徑和方法對差異表達的候補的cDNA/mRNA分子進行確證，這種方法包括Northern雜交，RNase保護或定量PCR。套用mRNA原位雜交技術能夠對來自某種疾病或不同發育階段的組織和差異表達的特異轉錄產物進行組織定位。
