原生質體培養

原生質體

是指用特殊方法脫去了植物細胞壁的、裸露的、有生活力的原生質團。沒有細胞壁，但具有活細胞的一切特徵。

①無細胞壁障礙，可以方便地進行有關遺傳操作，並可以對膜，細胞器等進行基礎研究。

②具有全能性，並能進行人工培養發育成完整植株。

③原生質體適合進行誘導融合形成雜種細胞。

主要來源：植物的葉片，根尖，花粉，愈傷組織細胞等。

機械分離法：常用於分離藻類原生質體，採用滲透方法使細胞發生質壁分離，用刀把細胞壁切破，使原生質體流出。（手工操作難度大，得率低，費時費力）

酶解分離法：用酶（瓊脂酶，果膠酶，纖維素酶等）將細胞壁分解。（條件溫和，原生質體完整性好，活力高，得率高）因此原生質體製備多採用酶解法，此法操作過程分為：取材消毒，酶解製備，原生質體收集。

原生質體的純化方法：沉降法、漂浮法、界面法。

即檢驗所獲得的原生質體是否是真正的原生質體

（1）低滲脹破法：把原生質體放入低滲透溶液中，在顯微鏡下觀察原生質體從低滲溶液中吸水脹破的過程。如果是真正的原生質體，因為沒有細胞壁，這樣在脹破後留下的殘跡應該是無形的。如果原生質體還帶有部分細胞壁，則原生質體從無壁部分吸水向外膨脹直至脹破，破碎後留下的殘跡仍保持半圓形的細胞壁。

（2）螢光染色法：將原生質體放入離心管中，加入0.7mol/L甘露醇配置的 0.05%～0.1%螢光增白劑溶液，染色5～10min，離心、洗滌除去多餘的染料，在螢光顯微鏡下觀察。綠色光顯示纖維素的存在，發出紅色光的是沒有纖維素的真正的原生質體

檢驗原生質體是活細胞還是死細胞

染色法：

①二乙酸螢光素（FDA）法：FDA本來沒有螢光，當其進入細胞後被脂酶分解為具有螢光的極性物，不能透過質膜，而是留在細胞內發出螢光。因此能發出螢光的是具有活性的原生質體。

②酚藏花紅染料法：具有活力的原生質體吸收染料顯紅色；無活力的不能吸收染料而顯示白色。

③伊文思藍染色法：有活力的細胞不能吸收染料為無色；而沒活力的細胞則能吸收染料顯藍色。

其他法：①胞質環流法②滲透壓變化③氧電極法④形態觀察法

主要有液體淺層培養法、液體懸滴培養、固體平板法、固液雙層培養法（套用最廣泛）、瓊脂糖珠培養法

經原生質體培養的植株再生一般經過細胞壁再生，細胞分裂成細胞團、愈傷組織（或胚狀體）、植株再生這幾個過程。